黄麻种子提取物对人膀胱癌T24细胞增殖的抑制作用

朱云国，施华娟，程舟*，杨晓伶，李珊，奚秀洁，俞悦纯，吕彤，武健壮

(1.同济大学生命科学与技术学院，上海 200092；2.上海市普陀区人民医院，上海 200060)



黄麻种子提取物对人膀胱癌T24细胞增殖的抑制作用

朱云国1，施华娟2，程舟1*，杨晓伶1，李珊1，奚秀洁1，俞悦纯1，吕彤1，武健壮1

(1.同济大学生命科学与技术学院，上海 200092；2.上海市普陀区人民医院，上海 200060)

为探讨黄麻种子抗膀胱癌的效果，选取圆果种黄麻“179”、长果种黄麻“中黄麻4号”和“福黄麻2号”三种黄麻种质，利用MTT法分析了种子乙醇提取物对膀胱癌细胞增殖的影响。结果表明，长果种和圆果种黄麻种子提取物对人膀胱癌T24细胞增殖的抑制率均极显著高于目前临床一线药物丝裂霉素，且长果种显著优于圆果种，但2个长果种品种间差异不显著。因此，有望从黄麻种子中开发出高效抗膀胱癌成分，这将有助于膀胱癌治疗及黄麻种质资源的综合利用。

黄麻；种子；膀胱癌；抗癌活性

黄麻为椴树科(Tiliaceae)黄麻属(Corchorus)一年生韧皮纤维作物，是麻纺和造纸工业的重要原料。黄麻属约有40-100个种，遍布整个热带和亚热带地区。目前世界上主栽的黄麻主要有两个种，即长果种黄麻(CorchorusolitoriusL.)和圆果种黄麻(CorchoruscapsularisL.)[1-2]。黄麻属植物种子有毒，内含大量强心苷类化合物(Cardiac Glycosides, CGs)[3]。已有研究发现强心苷类化合物具有抗癌活性[4-6]。

膀胱移行细胞癌(Bladder Transitional Cell Carcinoma, BTCC)是泌尿系统最常见的恶性肿瘤，发病率居世界恶性肿瘤第九位、居我国泌尿系统恶性肿瘤第一位。虽然70%-80%的初发膀胱癌为非浸润性(也称为表浅性)，但术后易复发，其复发率高达70%，并有约15%的患者发展为浸润性膀胱癌[7]。目前临床上主要采用经尿道膀胱肿瘤切除术(TUR-BT)后定期膀胱灌注丝裂霉素(MMC)等药物来预防非浸润性膀胱癌的复发与进展。但目前临床一线药物丝裂霉素等存在有效率低(仅为30%-40%)和毒副作用大的问题，迫切需要开发新的高效低毒的抗膀胱癌药物[8]。

黄麻种子提取物对膀胱癌细胞的增殖有何影响？是否具有抗膀胱癌功效？能否被用于膀胱癌治疗？目前尚无相关研究报道。本研究采用MTT法探讨圆果种黄麻“179”、长果种黄麻“中黄麻4号”和“福黄麻2号”三个黄麻种质提取物对人膀胱癌T24细胞增殖的影响，为进一步从黄麻种质资源中分离出高效抗膀胱癌成分奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

实验材料为圆果种黄麻“179”、长果种黄麻“中黄麻4号”和长果种黄麻“福黄麻2号”的种子。人膀胱癌T24细胞购自中国科学院细胞库，丝裂霉素购自浙江海正药业股份有限公司，二甲基亚砜(DMSO)和四甲基噻唑蓝(MTT)购自Sigma，1640培养液、胰酶和小牛血清购自GE公司的HyClone。

1.2 黄麻种子提取物的制备

称取圆果种黄麻“179”和长果种黄麻“中黄麻4号”种子各100 g，经粉碎后，分别加入95%乙醇溶液1 L，室温下密闭浸泡2 h，70℃水浴回流提取3 h。共提取2次，合并收集2次乙醇提取物，过滤后用旋转蒸发仪浓缩分别得浸膏13.4 g(得率为13.4%)和13.6 g(得率为13.6%)，分别记为提取物“Y1”和“C1”，-20℃保存备用。

称取长果种黄麻“中黄麻4号”和长果种黄麻“福黄麻2号”种子各100 g，经粉碎后，分别加入500 mL石油醚室温浸提脱脂48 h。过滤后取沉淀再用95%乙醇溶液1 L在室温下密闭浸泡2 h，70℃水浴回流提取3 h。共提取2次，合并收集2次乙醇提取物，过滤后用旋转蒸发仪浓缩分别得浸膏8.9 g(得率为8.9%)和9.2 g(得率为9.2%)，分别记为提取物“C1TZ”和“C2TZ”，-20℃保存备用。

1.3 细胞形态观察

取对数生长期的T24细胞铺6孔板，每孔约100000个细胞，生长24 h后，分别换加含有1 mg/mL的提取物“Y1”或“C1”的1640培养液(含10%小牛血清，下同)，对照为不含提取物的1640培养液，培养12 h后，在尼康倒置显微镜下观察细胞形态并拍照。

1.4 MTT实验

取对数生长期的T24细胞，胰酶消化后调配成10万个细胞/mL的细胞悬液，以每孔100 μL接种于96孔板中。过夜细胞贴壁后，以加100 μL含0.2、1、2、10和20 μg/mL黄麻种子提取物的1640培养液为给药处理，以加100 μL含10、20、100和200 μg/mL丝裂霉素的1640培养液为阳性对照，以加100 μL不含药物的1640培养液为空白对照。每个处理设6次重复。培养 24 h 后，每孔加入5 g/L MTT溶液20 μL，再培养4 h后取出，离心去上清液，每孔加150 μL DMSO，低速振荡10 min后，用多功能酶标仪测490 nm 的OD值，重复3次。计算黄麻种子醇提取物和丝裂霉素对人膀胱癌T24细胞增殖生长的抑制率，并计算IC50值。

1.5 统计方法

数据核对整理后，用SPSS 19.0计算IC50值，并进行单因素方差分析，采用最小差异显著法进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 黄麻种子提取物对T24细胞形态的影响

培养12 h后，黄麻种子醇提取物对T24细胞的生长有明显影响(图1)。不含提取物培养时T24细胞贴壁生长，细胞形态正常、结构完整清晰、生长良好，增殖快(图1 A)。含1 mg/mL黄麻种子醇提取物“Y1”(图1 B)和“C1”(图1 C)培养时，T24细胞或脱落漂浮于培养液中、或出现空泡、或破碎只剩碎片。表明黄麻种子醇提取物能引起人膀胱癌T24细胞大量死亡，且长果种黄麻“中黄麻4号”种子的醇提物(图1 C)比圆果种黄麻“179”种子的醇提物(图1 B)效果更好。

A：对照(不含提取物)，B：含1 mg/mL提取物“Y1”，C：含1 mg/mL提取物“C1”

2.2 黄麻种子提取物对T24细胞增殖的抑制作用

培养24 h后，MTT结果显示，黄麻种子提取物“Y1”、“C1”、“C1TZ”和“C2TZ”对T24细胞增殖的抑制有明显的剂量效应，在0.1-10 μg /mL的范围内，抑制率随浓度加大而升高。在5和10 μg /mL浓度下，黄麻种子提取物“Y1”、“C1”、“C1TZ”和“C2TZ”对T24细胞增殖的抑制率均显著高于对照丝裂霉素，分别是丝裂霉素的2.07、2.61、2.59、2.56和1.64、1.83、1.84 、1.82倍。圆果种黄麻“179”种子的醇提物(“Y1”)在5个浓度水平对T24细胞增殖的抑制作用均显著小于长果种黄麻“中黄麻4号”种子的醇提物(“C1”)，与对T24细胞形态观察结果一致(图1)。提取物“C1TZ”和“C2TZ” 在5个浓度水平对T24细胞增殖的抑制率无显著性差异，表明对T24细胞增殖的抑制作用在2个长果种黄麻品种间无显著性差异。在0.1 μg /mL和1 μg /mL浓度时，提取物“C1”对T24细胞增殖的抑制率均显著小于提取物“C1TZ”，这表明黄麻种子提取物对T24细胞增殖的活性成分主要在高极性的乙醇中而不是低极性的石油醚中。

注：图标“Y1”、“C1”、“C1TZ”和“C2TZ”详细内容见表1；相同浓度下不同小写字母之间表示处理间差异达到5%显著水平

作用T24细胞24 h后黄麻种子提取物的IC50值均极显著低于对照丝裂霉素，分别是丝裂霉素的22.5%、7.7%、5.8%和5.4%(表1)。可见，黄麻种子醇提取物有望开发成高活性的抗膀胱癌药物，具有良好的开发应用前景。黄麻种子提取物“Y1”作用T24细胞24 h后的IC50值均显著高于提取物“C1”，表明圆果种黄麻“179”种子的醇提物的抗膀胱癌活性显著小于长果种黄麻“中黄麻4号”种子的醇提物，与上面的观察结果一致。

表1 不同黄麻种子提取物处理T24细胞24 h后的IC50值

3 讨论与结论

本研究表明长果种和圆果种黄麻种子提取物对T24细胞增殖的抑制作用均极显著高于目前的临床一线药物丝裂霉素，并能引起T24细胞大量死亡。可见，长果种和圆果种黄麻种子提取物对膀胱癌细胞具有比丝裂霉素更强的杀伤作用，有望开发出高效的抗膀胱癌药物。另有研究报道长果种黄麻种子的醇提取物对人多发性骨髓瘤细胞ARH-77有明显杀伤作用[9]。

长果种和圆果种黄麻种子醇提取物的抗膀胱癌活性成分尚不清楚。2012年Hong & Choi[10]研究发现强心苷布法林通过诱导凋亡来杀伤膀胱癌T24细胞。黄麻属植物种子有毒，内含大量强心苷类化合物，推测长果种和圆果种黄麻种子提取物的抗膀胱癌活性成分可能与某种强心苷物质有关。强心苷又称强心甙或强心配糖体,是一类对心肌有显著兴奋作用的甾体苷类化合物，由强心苷元和糖缩合而成。强心苷类化合物除具有强心作用外，还具有预防和治疗癌症作用[11]。强心苷类化合物对包括人乳腺癌、前列腺癌、结肠癌、非小细胞肺癌等多种癌症细胞均具有抑制增殖和诱导凋亡的作用，且与正常细胞相比，CGs与癌症细胞的亲和力更高[5-6]。已有研究表明强心苷类化合物的种类和含量在黄麻种间及种内存在差异[3]。不同结构类型的强心苷抗癌活性不同[4-6]。本研究发现长果种黄麻“中黄麻4号”种子的提取物对T24细胞增殖的抑制作用显著高于圆果种黄麻“179”，而长果种黄麻“中黄麻4号”和“福黄麻2号”品种间差异不显著。这可能与长果种和圆果种黄麻种间强心苷的种类和含量的差异比种内差异更大有关。

本研究表明长果种和圆果种黄麻种子有望开发成高效的抗膀胱癌活性成分，有极大的研究和开发潜力。黄麻易种植，不与粮、棉等大宗农作物争地，可利用开发山地、盐碱地等荒地资源。若能从黄麻种子中开发上市具有广阔应用前景的抗膀胱癌新药，则将大力促进黄麻的种植，增加贫困偏远地区麻民的收入，对膀胱癌治疗和黄麻种质资源综合开发均利用具有重要意义。

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Inhibiting Effect of Jute Seed Extracts on Proliferation of Human Bladder Cancer T24 Cells

ZHU Yun-guo1，SHI Hua-juan2，CHENG Zhou1*，YANG Xiao-ling1，LI Shan1，XI Xiu-jie1，YU Yue-chun1，LYU Tong1，WU Jian-zhuang1

(1. School of Life Science and Technology, Tongji University, Shanghai 200092, China;2. People's Hospital of Shanghai Putuo District, Shanghai 200060, China)

In order to investigate the anti-bladder cancer activity of jute seed, inhibiting effects of seed extracts of three jute germplasm (Corchoruscapsularis“179” andCorchorusolitorius“Zhonghuangma No.4 and Fuhuangma No.2”) on proliferation of bladder cancer cells were analyzed by MTT assay. The results showed that the seed ethanol extracts of these three jute germlasm significantly inhibited the proliferation of T24 bladder cancer cells as compared with the current clinical first-line-medicine, Mitomycin. The extract ofC.olitoriuswas much more effective than that ofC.capsularis, while there was no significant difference between two varieties ofC.olitorius. Therefore, jute seed is expected to be developed a highly active anti-bladder cancer drug, which will benefit for the treatment of bladder cancer and the comprehensive utilization of jute resources.

jute；seed；bladder cancer；anticancer activity

1671-3532(2015)06-0312-05

2015-07-01

上海市卫生局青年项目(20114Y134);国家大学生创新训练计划项目和同济大学大学生创新训练计划项目

朱云国(1977-)，男，博士，讲师，研究方向：植物种质资源遗传多样性评价、挖掘及利用研究。E-mail: ygzhu77@163.com。

*通讯作者：程舟(1967-)，男，博士，教授，研究方向：植物种质资源遗传多样性评价、挖掘及利用研究。E-mail: chengzhou@tongji.edu.cn。

S563.4

A