柞蚕丝素/聚乳酸纳米纤维纱的制备及其生物学性能

韩啟明， 何建新， 谭卫琳， 余志才， 邵伟力

(1. 中原工学院 河南省功能性纺织材料重点实验室， 河南 郑州 450007； 2. 中原工学院 纺织服装产业河南省协同创新中心, 河南 郑州 450007； 3. 天津工业大学 纺织学院， 天津 300387)



柞蚕丝素/聚乳酸纳米纤维纱的制备及其生物学性能

韩啟明1,2， 何建新1,2， 谭卫琳1,2， 余志才1,2， 邵伟力3

(1. 中原工学院 河南省功能性纺织材料重点实验室， 河南 郑州 450007； 2. 中原工学院 纺织服装产业河南省协同创新中心, 河南 郑州 450007； 3. 天津工业大学 纺织学院， 天津 300387)

为制备力学性能、可加工性、生物学性能良好的骨组织支架材料，利用双重共轭静电纺丝装置制备了4种不同成分比例的柞蚕丝素(TSF)/聚乳酸(PLA)纳米纤维纱线。分别通过SEM、红外光谱和细胞体外培养表征了纱线的形态、二次结构和生物学性能。结果表明：TSF质量分数为10%时，成纱条干均匀，毛羽较少，纱线中纤维直径较细，力学性能有所改善。细胞在体外培养不同时间后，TSF 质量分数为10%的复合纳米纤维纱(PLTF)支架材料上的细胞具有较好的细胞形态和较多的细胞数量，因此PLTF支架材料能够作为合适的支架用于骨组织工程。

柞蚕丝素； 聚乳酸； 静电纺； 纳米纤维纱； 生物学性能

组织工程学是一门新兴学科，主要研究人体组织和器官的修复或构建，涉及细胞生物学、工程学以及材料学[1-2]等学科。利用静电纺丝方法制备的基于纳米纤维的仿生支架材料在组织工程中作为替代材料具有较大的潜力，因为相比较于宏观、微观支架材料，静电纺丝纳米纤维支架材料较大的比表面积，高孔隙率以及纳米尺特性提供了更好的细胞与仿生材料界面环境[3-4]。目前用于制备基于纳米纤维的仿生支架材料中的纳米纤维结构大都为不同类型的纤维毡，力学性能差，难以重复加工。如果能利用静电纺丝的方法纺出纳米纤维纱线[5]，纤维将沿着纱的轴向平行排列，相对于纤维毡具有较好的力学性能，而且可利用机织或针织技术加工成不同形式的结构材料。丝素蛋白是具有生物活性的天然高分子材料[6]，尤其是柞蚕丝素蛋白具有丰富的丙氨酸残基和Arg-Gly-Asp三肽序列，这种序列可用作生物识别，有利于细胞的黏附、增殖，使得TSF更适合生物学应用[7-8]。PLA具有较好的生物相容性，在体内可降解成乳酸，同时其具有较好的静电可纺性[9]。在骨生长修复过程中，成骨细胞是主要的组织形成细胞，目前已经建立了多种成骨细胞实验模型用于体外研究，常用的有MG-63、MC-3T3、原代培养的成骨细胞等[10-12]。

本文通过自行搭建对称四喷头的高压静电纺纳米纤维纱装置制备出柞蚕丝素(TSF)和聚乳酸(PLA)不同成分比例的复合纳米纤维纱，为骨组织工程提供了具有一定力学性能和良好生物性能的支架材料。

1 实验部分

1.1 原材料

柞蚕蚕茧，聚乳酸 (PLA，重均相对分子质量10 000)；人成骨肉瘤细胞(MG-63细胞)，购自中国国家实验细胞资源共享平台；聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)，若丹明-毒伞素，四甲基偶氮唑蓝(MTT)细胞增殖检测试剂盒，购自 Sigma 公司；使用的其他试剂均为分析纯，不需要提纯。

1.2 制备不同TSF质量分数的纺丝溶液

用0.5%的碳酸钠溶液在98 ℃对柞蚕蚕茧煮练脱胶处理3次，每次35 min。在50 ℃用硫氰酸锂溶液将脱胶后的柞蚕丝溶解2 h 得到丝素粗溶液，然后将过滤后的丝素粗溶液倒入透析袋(截流相对分子质量为8 000～14 000)中透析3 d。将透析后的柞蚕丝素稀溶液在无菌室中室温下鼓风浓缩至溶液的质量分数为10%后，放入冰箱冷藏一晚后用冷冻干燥机干燥。按照纺丝溶液质量分数为8%的配比，分别称取TSF和PLA加入六氟异丙醇中，在通风橱中室温下磁力搅拌1周，得到纺丝溶液。

1.3 制备不同TSF质量分数的纳米纤维纱

按照图1所示复合纳米纱制备装置示意图搭建静电纺丝装置，以制备TSF和PLA不同成分比例的纳米纤维纱。两端的注射泵将纺丝溶液匀速地输送到各喷头，开启高压发生器后在正、负间形成高压电场，喷头头端的溶液液滴在高压电场作用下首先形成泰勒锥，在电场力的进一步作用下分散形成多股射流，直到细化为纳米纤维集聚到旋转的金属喇叭口边缘，绝缘棒在喇叭口中心开始牵引纤维，先形成倒锥形的纤维网，随后成纱卷绕到旋转卷绕辊上匀速收集纱线。纺丝电压为18 kV，纺丝溶液总流量为0.9 mL/h(正、负喷头流量比2∶1)，正负喷头间距为17.5 cm，喷头内径为0.5 mm，金属喇叭转速为100 r/min，纱线收集速度为53 mm/min。

图1 TSF/PLA复合纳米纱制备装置示意图Fig.1 Preparation device schematic diagram of TSF/PLA composite nanofiber yarns

1.4 纺丝液的特性测试

使用DDS-11A型电导率仪和NDJ-8S旋转黏度计对不同种类的溶液进行测试。每种溶液测试5次，取其平均值。

1.5 纤维纱表面形貌观察

采用 JSM-6360 型电子扫描显微镜观察复合纳米纤维纱表面形貌。测试前样品进行镀金处理，加速电压为15 kV。

1.6 红外光谱测试

使用NEXUS670型红外-拉曼光谱仪对不同TSF质量分数的复合纳米纤维纱进行红外光谱分析。测试条件为：室温20～25 ℃，相对湿度60%以下，分辨率2 cm-1，每个样品扫描10次。

1.7 力学性能测试

利用SmileView软件对不同的复合纳米纤维纱线的SEM照片进行处理得到纱线平均直径。用Instron3365电子强力仪测试不同种类的TSF/PLA纳米纤维纱的拉伸性能。每种纱线测试前需重置纱线直径参数，所有纱线均在夹持长度10 mm，拉伸速度10 mm/min以及初始张力为0.2 cN的条件下进行。每种纱线样品重复测定10次，取其平均值。

1.8 细胞生长情况分析

对培养1、4 d后的细胞支架材料进行荧光染色分析，先用多聚甲醛固定细胞，Triton X-100(聚乙二醇辛基苯基醚)溶液处理细胞以获得通透性细胞，然后用若丹明-毒伞素和DAPI(4′，6-二脒基-2-苯基吲哚)分别对细胞膜、基质和细胞核进行染色。最后在荧光显微镜(尼康E200)下观察。

1.9 细胞增殖活性分析

在预定培养天数(1、4和7 d)后，将MG-63细胞培养在含有MTT(5 mg/mL)的检测试剂盒中，在37 ℃下继续培养 4 h。终止培养并去除上清液，每孔添加420 μL DMSO振荡10 min，各孔移取100 μL溶液至96 孔平底培养板，在酶联免疫检测仪上选择492 nm 波长测定各孔吸光度值。

1.10 实验数据的分析处理

采用SPSS13.0统计软件对实验数据进行统计分析处理，以监测数据的可靠性，每组内采集的多个数据使用重复测量方差法进行分析，组间的数据比较分析采用t检验，当p<0.05时获得的分析值被认为可靠，具有统计学意义。

2 实验结果与讨论

2.1 TSF/PLA复合纳米纤维纱的形貌

由相同的纺纱条件制备的不同质量比的TSF和PLA复合纳米纤维纱的SEM照片如图2所示。可看出，纯的TSF因较差的力学性能难以连续成纱，而纯的PLA显示了较好的可纺性。图3示出不同TSF质量分数纺丝溶液的黏度和电导率。如图所示，质量分数为8%的PLA纯溶液具有较高的黏度，而电导率较低。纯的PLA纳米纤维纱具有均匀的捻回分布，纳米纤维纱中纤维几乎沿捻向平行排列，但是纳米纤维的直径较大，约1 000 nm，相应的纳米纤维纱也具有较粗的直径(130 μm)。

注：内嵌图像放大倍数为6 000。图2 不同TSF质量分数的复合纳米纤维纱的SEM图片(×500)Fig.2 SEM images of composite nanofiber yarns with different TSF mass fraction (×500)

图3 不同TSF质量分数的纺丝溶液的黏度/电导率图Fig.3 Viscosity/conductivity images of spinning solution with different TSF mass fraction

当TSF质量分数为10%时，纺丝溶液黏度迅速降低，而电导率有所增加，纤维成纱直径显著降低至500 nm，并且成纱的条干显著改善(70 μm)，毛羽减少。这是因为柞蚕丝素蛋白大分子的侧基上含有很多的极性基团，这些侧基在电场中产生电荷增加了纺丝溶液的导电率，另外与PLA大分子的相互作用降低了纺丝溶液的黏度，从而纺丝溶液的射流在更强的电场力作用下能得到更加充分的拉伸。

当TSF的质量分数超过15%后，纺丝液的电导率急剧增加，而黏度几乎保持稳定。在纺丝过程中，纤维不能稳定地在喇叭口上集束，牵引出的纱线条干显著恶化，表面毛羽显著增多，而纳米纤维纱中纤维的直径分布呈现两极化趋势。其原因是随着电导率的增加，同极射流间的排斥产生了大量的飞花，增加了纤维在喇叭口边缘的集聚难度。

2.2 红外光谱分析

TSF/PLA复合纳米纤维纱的红外光谱如图4所示。纯PLA纳米纤维纱在1 759、1 456、1 387、1 269和1 182 cm-1处有特征吸收峰。添加TSF后，复合纤维纱的红外吸收光谱图在1 654、1 544、1 517、1 261和1 229 cm-1处出现了柞蚕丝素蛋白的吸收峰，其中归属于α螺旋和无规卷曲的吸收峰(1 654 和1 544 cm-1)较强，归属于β折叠的吸收峰(1 517和1 230 cm-1)较弱。随着TSF质量分数的增大，柞蚕丝素蛋白归属于α螺旋、无规卷曲的吸收峰强度明显增强，而在1 230 cm-1处归属于β折叠的吸收峰逐渐被覆盖，这说明在TSF/PLA复合纳米纤维纱中TSF以α螺旋、无规卷曲和β折叠结构共存，其中主要的构象是α螺旋和无规卷曲。这是因为射流从针头射出后形成的纤维在极短时间內集聚成束，丝素大分子没有足够时间调整构象。

图4 不同TSF质量分数复合纳米纱线的红外光谱图Fig.4 FT-IR spectra of composite nanofiber yarns with different TSF mass fraction

2.3 力学性能分析

在相同纺纱条件下，不同成分比例的纺丝溶液制得的TSF/PLA复合纳米纱线的应力-应变曲线如图5所示。纯的PLA显示了较好的力学性能，添加少量TSF对纱线的力学性能影响不大，但当TSF含量超过15%以后，纳米纤维纱的力学性能显著下降，这可能是由于纺丝溶液发生相分离，脆性的TSF破坏了纤维中PLA大分子相的连续性。另外，恶化的纱线条干也使得纱线的力学性能下降。

图5 不同TSF质量分数的复合纳米纤维纱的应力-应变曲线Fig.5 Stree-strain curve of composite nanofiber yarns with different TSF mass fraction

2.4 生物学性能分析

细胞的黏附、扩散和增殖是评价特定骨材料细胞相容性和适应性的重要参数。本文实验选取了力学性能较好的2种纳米纤维纱支架材料，通过形态学观察、MTT法检测细胞在材料表面早期的黏附、增殖，评价了纳米纤维纱支架材料的生物学性能。图6示出M9-63细胞在纯PLA和PLTF支架材料上培养不同天数后的荧光显微镜照片。

在培养1 d和4 d 后对细胞进行染色处理，盖玻片上生长的细胞作为对照组。培养1 d后荧光图像显示MG-63细胞在PLTF(丝素质量分数为10%的纱线)支架材料上具有良好的黏附和增殖性，细胞伸展充分，形状规整，可清晰地观察到细胞的纤维肌动蛋白和丝状伪足。MG-63细胞在盖玻片和PLA(纯的PLA纱线)支架材料上的细胞数量相当但明显低于PLTF支架材料。培养到第4天，PLTF支架材料上的MG-63细胞已经开始出现紧密排列，相互黏连。而PLA支架材料上大部分MG-63细胞分散分布呈现单细胞形态。总的来说，图6中的结果显示，接种在PLTF支架材料表面成骨细胞的蔓延，移动和伸展相较于其他支架材料上的细胞要更快一些，结果表明PLTF支架具有更好的能力以促进细胞在体外的增殖。

培养在不同支架材料上的MG-63细胞的MTT数据如图7所示。

由图7可看出，培养1 d后，所有支架材料的OD(吸光度)值没有显著差异(p>0.05)，培养4 d和7 d以后，MG-63细胞在PLTF上的增殖活性明显高于对照组和PLA支架(p<0.05)，表明PLTF支架材料中TSF的添加能够极大地促进MG-63细胞的增殖。有趣的是，在PLA支架材料上培养的MG-63细胞增殖活性一直很缓慢，只有在第7天才显著增加，但均低于PLTF和对照组支架材料，产生的这种差异可能是由于PLA支架材料表面的极性基团较少不利于细胞的黏附与增殖。

图6 MG-63细胞在纯PLA和PLTF支架材料上培养不同天数后的荧光显微镜照片Fig.6 Fluorescence microscope images of MG-63 cells cultivated on pure PLA and PLTF scaffold after different days. (a) Coverslip-1 day; (b) Coverslip- 4 day; (c) Pure PLA-1 day; (d) Pure PLA- 4 day; (e) PLTF-1 day;(f) PLTF- 4 day

图7 通过MTT分析MG-63细胞在不同支架材料表面增殖情况的直方图Fig.7 Histogram of MG-63 cells proliferation on different scaffold surface by MTT assay

3 结 论

本文实验通过静电纺丝方法制备了类似于骨中高度取向胶原的柞蚕丝素/聚乳酸PLA/TSF混合纳米纤维纱。研究了不同丝素质量分数静电纺纱线的形态和力学性能。加入少量柞蚕丝素，复合纳米纤维纱和纱中纤维的直径都有明显降低，其中纱线的直径由130 μm降至70 μm，纤维的直径由1 000 nm降至500 nm，纱线的形貌和力学性能明显获得了优化。当TSF质量分数超过15%后，纺丝溶液开始出现分离，同种纱线中纳米纤维呈现2种分布差异，一部分纤维平均直径500 nm，另一部分平均直径1 000 nm。总的来说，柞蚕丝素含量为10%的TSF/PLA复合纳米纤维纱具有较细的纤维直径(500 nm)，均匀的纱线细度(70 μm)和较好的力学性能(37.58 MPa)。生物相容性分析也证明了质量分数为10%的TSF静电纺纳米纱线支架材料相比于纯的PLA支架材料能提供更好的微观环境以仿生自然细胞外基质，可作为理想的骨组织工程支架材料。

[1] ROCHA F G, WHANG E E.Intestinal tissue engineering: from regenerative medicine to model systems[J].J Surg Res, 2004, 120:320-325.

[2] LAVIK E, LANGER R. Tissue engineering: current state and perspectives[J]. Appl Microbiol Biotechnol, 2004, 65:1-8.

[3] AMIT K Jaiswal, SACHIN S Kadam, VIVEK P Soni, et al. Improved functionalization of electrospun PLLA/gelation scaffold by alternate soaking method for bone tissue engineering[J]. Applied Surface Science, 2013,268:477-488.

[4] KATIA Rodriguez, JOHAN Sundberg, PAUL Gatenholm, et al. Electrospun nanofibrous cellulose scaffolds with controlled microarchitecture[J]. Carbohydrate Polymers,2014,100:143-149.

[5] WANG L, NEMOTO R, SENNA M, et al. Changes in microsture and physico-chenical properties of hydroxyapatite-silk fibroin nanocomposite with varying silk fibroin content[J]. Eur Ceram Soc, 2004, 24:2707-2715.

[6] HE J X, WANG Y, CUI S Z, et al. Structure and miscibility of tussah silk fibroin/carboxymethyl chitosan blend films[J]. Iran Polym, 2010,19:625-633.

[7] MINOURA N, AIBA S I, HIGUCHI M, et al. Attachment and growth of fibroblast cells on silk fibroin[J]. Biochem Biophys Res Commun, 1995,8:511-516.

[8] 黄江鸿,王大平, 刘建全, 等. 新型聚乳酸复合纳米羟基磷灰石人工骨的细胞相容性[J].实用骨科杂志, 2012,18(4):323-326 HUANG Jianghong, WANG Daping, LIU Jianquan, et al. New polylactide nano-hydroxyapatite composite artificial none cells compatibility[J].Journal of Practical Orthopaedics, 2012,18(4):323-326.

[9] 夏大弘. 成骨细胞体外培养在种植相关研究中的应用[J].国外医学口腔医学分册, 2001,28(2):73-75. XIA Dahong. Osteoblasts in vitro in planting the application of the related research[J].Foreign medical archies of oral medicine, 2001,28(2):73-75.

[10] SCHULER M, OVEN G R, HAMILTON D W, et al. Biomimetic modification of titanium dental implant model surfaces using the RGDSP-peptide sequence: a cell morphology study[J]. Biomaterials,2006,27(21):4003-4015.

[11] KIM H K, IANG J W, LEE C H, et al.Surface modification of implant materials and its effect on attachment and proliferation of bone cells[J].J Mater Med, 2004,15(7):825-830.

[12] 何建新,余志才,韩啟明, 等.柞蚕丝素/聚乳酸复合纳米纤维纱的制备[J].上海纺织科技, 2014,42(7):38-40. HE Jianxin, YU Zhicai, HAN Qiming, et al. Preparation of tussah fibroin/poly lactic acid composite nanofiber yarn [J].Shanghai Textile Science and Technology, 2014,42(7):38-40.

Preparation and biological properties of tussah fibroin/polylactic acid nanofiber yarns

HAN Qiming1,2， HE Jianxin1,2， TAN Weilin1,2， YU Zhicai1,2， SHAO Weili3
(1.HenanKeyLaboratoryofTextileMaterials,ZhongyuanUniversityofTechnology,Zhengzhou,Henan450007,China; 2.TextileandApparelIndustryCollaborativeInnovationCenterofHenan,ZhongyuanUniversityofTechnology,Zhengzhou,Henan450007,China; 3.SchoolofTextiles,TianjinPolytechnicUniversity,Tianjin300387,China)

Tussah fibroin (TSF)/polylactic acid (PLA) composite nanofiber yarns with different ratios of TSF to PLA were prepared to fabricate tissue scaffold with great mechanical properties, good processability and biological properties by a double conjugation static-spinning device. The scanning electronic microscopy (SEM) and infrared spectroscopy (FT-IR) and cell culture in vitro were used to characterize the morphology, secondary structure and biological properties of the yarns separately. The result indicates that the yarn with the ratio of TSF to PLA of 1∶9 gains smaller diameter, uniform evenness as well as less hairiness and better mechanical. After being cultured in vitro for different time, the yarn with the ratio of TSF to PLA of 1∶9 as tissue scaffold keep healthy and more cell counts to make the PLTF yarn suitable as appropriate scaffold for bone tissue engineering.

tussah fibroin; polylactic acid; electrostatic spinning; nanofiber yarn; biological property

10.13475/j.fzxb.20141007806

2014-10-29

2015-06-16

国家自然科学基金项目(51203196)；NSFC-河南人才培养联合基金项目(U1204510)；河南省教育厅科学技术研究重点项目(14A540003，14A540006)；郑州市普通科技攻关项目(141PPTGG400)

韩啟明(1989—)，女，硕士生。主要研究方向为纳米生物材料。何建新，通信作者， E-mail：hejianxin 771117@163.com。

TS 102.1

A