HBV感染者DNA模板库的制备*

邓春青 冯珊珊

乙型肝炎病毒（HBV）感染是一个严重的公共卫生问题，我国1992年的血清流行病学调查结果提示：国内一般人群的乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）阳性率为9.75%[1]，属于HBV感染的高流行区。HBV感染后容易慢性化，与肝硬化和肝癌的发生显著相关，部分还可转变为重型肝炎[2]。目前在HBV感染的遗传易感性研究中，疾病关联研究最常用。笔者进行HBV感染候选基因的关联研究所需的大样本量较欧、美等发达地区更具优势。关键之处则在于将收集的大量样本抽提出DNA并制备成分型所用96孔模板，这无疑是进行疾病关联研究的基础和前提。

1 资料与方法

1.1 一般资料 研究对象选择本院传染科门诊及病房2012年2月-2014年12月就治的太原地区汉族居民，静脉抽取10 mL EDTA-K2抗凝晨血：5 mL用于基因组DNA提取；5 mL用于病毒标志和生化检测；同时填写详细的临床资料并输入计算机。样本收集过程按照国家人类基因组研究伦理学准则进行，获得了收集对象的知情同意。乙型肝炎依据2000年西安第十次全国病毒性肝炎会议修订“病毒性肝炎防治方案”制定标准诊断[3]，另外笔者收集了部分血站献血员作为正常对照。

1.2 方法

1.2.1 人白细胞基因组DNA提取 采用Miller盐析法[4]进行。（1）EDTA-K2抗凝全血5 mL，置于50 mL有盖圆底离心管内。（2）加6~8倍体积（约35~40 mL）蒸馏水，反复颠倒混匀，于4 ℃ 5000 g离心20 min。（3）倾倒上清后于沉淀中加入预冷的0.1%Triton-X100（约35~40 mL），轻柔混匀沉淀，再次于4 ℃ 5000 g离心20 min，然后弃上清。（4）加入2 mL裂解液于沉淀中，彻底打碎沉淀，然后加入10%SDS 100 μL至终浓度为0.5%，混匀。（5）加入10 mg/mL蛋白酶K 50 μL至终浓度为200 μg/mL，混匀，于55 ℃4 h或37 ℃过夜消化。（6）加入6.0M NaCl液0.7 mL，剧烈振荡20 s。（7）7000 g离心20 min，将上清移至50 mL有盖圆底离心管内。（8）加入2倍体积-20 ℃无水乙醇或95%乙醇，反复颠倒混匀，直至出现絮状沉淀，挑出DNA至一eppendorf管中。（9）1 mL 75%乙醇洗涤DNA两遍。自然晾干，用200 μL TE溶解DNA（4 ℃需要3~7 d）。（10）75%乙醇中的DNA离心，弃上清。（11）凝胶电泳确定所提DNA，UV计测定纯度和浓度，于TE中-20 ℃冻存。

1.2.2 模板的制备 （1）将所抽提的DNA样本定量后加水稀释至终浓度5~10 ng/μL置于96孔PCR板中。（2）每个96孔PCR板的最后2孔设为空白对照不加DNA样本。（3）用铝箔胶带封口。（4）于Eppendorf Centrifuge 5810R冷冻离心机中离心5 min。（5）置-20 ℃冰箱冻存备用。

2 结果

历时将近两年，去除因各种原因资料不全以及极少数抽提DNA不理想的样本，共收集到2561份DNA标本，全部制备成96孔模板。其中，男1940例，女621例，年龄21~75岁。

收集的病例包括急性乙型病毒性肝炎（AHB）15例，乙肝病毒携带者（AsC）279例，慢性乙型病毒性肝炎（CHB）1497例，肝癌（HCC）23例，肝硬化（LC）218例，重型乙型病毒性肝炎（SHB）168例，自身免疫性肝炎（AIH）15例，慢性丙型病毒性肝炎（CHC）16例，原发性胆汁性肝硬化（PBC）5例，其他原因所致疾病（Others）104例，同时收集正常献血员（BD）221例，详细患者临床资料见表1。

表1 所选患者临床资料

图1 全血基因组DNA

图2 铝箔胶带封口96孔模板

3 讨论

乙型肝炎呈世界性流行，不同地区HBV感染的流行强度差异很大，据世界卫生组织报道，全球约20亿人曾感染过HBV，其中3.5亿人为慢性感染者，每年约有100万人死于HBV感染所致肝衰竭、肝硬化和原发性肝癌。因此，它已成为严重威胁人类健康的世界性疾病，也是我国当前流行最为广泛、危害性最严重的一种疾病。本试验所收集到的HBV感染病例中，急性感染者仅占0.68%（15/2200），其余分别表现为慢性肝炎、乙型肝炎病毒携带、肝硬化甚至肝癌等慢性HBV感染状态。当然，除归结于诸多隐性HBV感染外[6]，HBV感染所致较高慢性化程度的本质也暴露无疑。笔者收集的病例包括乙肝病毒携带者、急性乙型病毒性肝炎、慢性乙型病毒性肝炎、肝硬化、肝癌等HBV感染所致的所有疾病谱。而且在收治的所有肝病中，确诊有HBV感染的占94.02%（2200/2340），再一次强势表明HBV感染仍是今后较长时期面临的主要疾病[5]，因而有关HBV感染的研究也将任重而道远。此外，自身免疫性肝病作为一种发病机理不明的疾病与许多疾病有关联，且由于最初的临床症状与病毒性肝炎症状相似，临床上诊断比较困难。因此，准确及时地监测出自身免疫性肝病的特异性自身抗体无疑对诊断以及进一步治疗具有重要意义。临床上最典型的自身免疫性肝病包括：原发性胆汁性肝硬化（PBC）和自身免疫性肝炎（AIH）。随着检测水平的不断提高和检测手段的日趋完善，原发性胆汁性肝硬化、自身免疫性肝炎等诸多自身免疫性肝病的诊断一定会愈来愈受到重视。

以生物学功能相关的基因作为候选基因进行疾病关联研究，是当前宿主遗传易感性研究的主要策略。关联研究是一种简单、实用的分析技术，就是发现存在于大量数据集中的关联性或相关性，从而描述了一个事物中某些属性同时出现的规律和模式。关联研究不必知道疾病的遗传模式、表现型比率、不完全外显率、遗传异质性等，便于设计及开展，而且大量样本可产生重复性良好的结果。关联研究最重要的是应该避免因群体混杂或分层而出现的虚假的阳性关联结果，为避免这种情况的发生，可采取一些措施：临床分型详细、适当；病例和对照应受相同病因作用，排除疾病异质性；样本量足够大；病例/对照性别、年龄匹配。本试验中笔者所收集到的样本量足够大，病例和对照人群来自太原地区，病例与对照之间的年龄、性别基本匹配，临床分型严格按照西安全国肝病会议制定的诊断标准执行，保证了进行关联研究的需要。

由于分散性的进行样本收集，笔者采取了一定的策略：零星收集标本后冻存，然后集中进行提取。收集标本的同时填写详尽的临床学资料并录入电脑，这样排除了样本重复的可能。笔者还将患者既往情况、既往住院病历从信息科一一调出核查证实以确保详实地反映患者的疾病状况尤其是HBV感染状态、肝脏功能等，另外，笔者收集标本、抽提DNA以及制作模板的过程当中，完全按所收集标本时间的先后顺序依次完成，始终未将患者的诊断考虑在内，从而保证了样本的随机性。

制备基因组DNA是进行基因结构和功能研究的重要步骤，通常要求得到的片段的长度不小于100~200 kb。在DNA提取过程中应尽量避免使DNA断裂和降解的各种因素，以保证DNA的完整性，为后续的试验打下基础。电泳鉴定提取的DNA如果不成区带，而是散开，则说明DNA已经被降解成小分子，不能再用来进行限制性酶切等基因研究。本试验所抽提人基因组DNA成完整区带，浓度较高、纯度较好、质量相当稳定，证实静脉血仍然是提取基因组DNA的最佳标本[7]。商业化DNA抽提试剂盒以及既往传统的酚/氯仿抽提法均需要分离外周血白细胞[8-9]，无法有效提取冻存血样；实际操作可行性小，以试剂盒提取大样本量的DNA花费过高，对笔者所收集的如此庞大的病例标本来说无疑代价高昂。在初始采用盐析法提取冻存全血基因组的过程中，笔者发现37 ℃过夜消化或加入蛋白酶K后于55 ℃消化4 h两者之间所提取的DNA有较大差别。无论所提取DNA的浓度、质量或者稳定性，经37 ℃过夜消化后均明显优于55 ℃消化4 h。故此笔者之后基本采取了加入蛋白酶K后于37 ℃过夜消化的方法。总而言之，采用盐析法提取冻存全血基因组DNA方便、经济，所提DNA质量稳定，UV计测定纯度和浓度后显示足以满足PCR扩增的需要。以此模板库为基础，诞生了许多重要的研究[10-15]。

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