垂直层叠结构的LED诱导荧光检测系统

杨晓博，闫卫平

(1.许昌学院电气工程学院，河南许昌 461000;2.大连理工大学电子科学与技术学院，辽宁大连 116024)



垂直层叠结构的LED诱导荧光检测系统

杨晓博1,2，闫卫平2

(1.许昌学院电气工程学院，河南许昌 461000;2.大连理工大学电子科学与技术学院，辽宁大连 116024)

为进一步减小光源的体积及简化光路系统结构，消除毛细管电泳芯片激光诱导荧光检测系统中激发光源的反射光和杂散光的干扰，降低系统的检测限，设计并建立了基于偏振隔离结构的垂直层叠式发光二极管诱导荧光检测系统。整个系统由发光二极管光源、两片线性偏振片、多通道毛细管电泳芯片、针孔、电荷耦合器件、高压电源、数据采集卡及数据处理单元等组成。在系统条件最优化的情况下，对罗丹明B样品溶液进行了毛细管电泳分离实验。

垂直层叠结构；毛细管电泳芯片；荧光检测；偏振片

0 引言

毛细管电泳(Capillary Electrophoresis,CE)芯片是微流控生物芯片的一种，广泛应用于蛋白质组分研究、药物筛选、基因诊断等生化分析领域[1]。阵列CE芯片由于能够同时对多种分析样品进行并行检测，效率更高、成本更低，已成为生化分析领域前沿的研究热点之一[2]。在利用CE芯片进行生化分析的过程中，被测样品的组分及含量等相关信息由检测系统来测定。由于CE芯片中毛细管的内径一般为10 ～ 100 μm，样品进样量极少，因而对检测系统的灵敏度、分辨率及响应速度都有较高的要求，检测系统的性能将直接决定CE芯片分析系统的整体性能[3]。

如何滤除掉激发光的干扰，使到达检测器的信号只包含有用的荧光信号，同时避免使用传统共聚焦型激光诱导荧光检测系统中体积较大的光学组件，已成为制约整个检测系统实现微型化的瓶颈[4-6]。本文中提出了一种成本相对较低、通用性较强的毛细管电泳芯片检测系统，系统以贴片式LED代替传统的半导体固体激光器作为光源，采用两片偏振方向互相垂直的线性玻璃偏振片滤除掉激发光对检测器的干扰，以线阵CCD为光电检测器件，大大减小了检测系统的体积，以罗丹明B溶液为样品在最优化条件下进行电泳分离，得到了较高的检测灵敏度。

1 检测系统的结构

基于CCD及偏振片的LED诱导荧光检测系统结构如图1所示。系统主要包括贴片式绿光LED激发光源，玻璃材质的多通道毛细管电泳芯片，2片偏振方向互相垂直的线性偏振片，线阵CCD器件，数据采集卡及计算机等。其中，两偏振片与毛细管电泳芯片成三明治结构，偏振片1位于激发光源与毛细管电泳芯片之间，与偏振片1偏振方向垂直的偏振片2位于电泳芯片的上方，用于滤除激发光的干扰，只允许荧光信号通过。为限制检测区域及提高检测系统的信噪比，将不同尺寸的针孔置于偏振片2和CCD之间。CCD检测到的荧光信号(峰值波长为580 nm)通过数据采集卡转换为数字信号，利用USB总线与计算机连接，通过基于Visual C++ 6.0的编程软件在计算机上实现数据的采集和显示。

图1 毛细管电泳芯片LED诱导荧光检测系统结构示意图

2 系统的设计及实现

2.1 实验试剂及元器件

实验过程中使用的化学试剂均为分析纯级别。不同浓度的罗丹明B荧光染色剂样品由10 mmol/L的固体样品溶于无水乙醇中配制而成；缓冲液为由89 mmol/L的三羟甲基氨基甲烷、89 mmol/L的硼酸和2 mmol/L的EDTA用去离子水配制而成的混合溶液，pH值为8.3。光源采用贴片式绿光LED，激发波长峰值为532 nm；偏振片采用NT-66182型线性玻璃偏振片；数据采集卡12位，采样频率为20 MHz。

系统中使用的CCD为TCD1304AP型器件。该器件主要包括：光敏单元、2个移位寄存器、2个转移栅电极、内部驱动信号逻辑电路和输出信号缓冲电路[5]。其中，感光区位于中央位置，光敏阵列由光电二极管组成；感光单元中的前面32个及后面14个单元称为哑元，没有信号输出，用Dn表示；中间的3 648个像素单元是有效的感光单元，用Sn表示。每个光敏单元的尺寸为8 μm × 200 μm。

2.2 毛细管电泳芯片结构设计

检测系统中使用的四通道毛细管电泳芯片结构如图2所示。芯片通道单元结构为基本的十字构型，尺寸为40 mm ×80 mm，其中，微通道深60 μm，宽约100 μm(深40 μm处)，样品进样通道长10 mm，分离通道长40 mm，相邻两分离通道间的距离为6 mm，十字交叉点处离检测点的距离为30 mm，储液池直径为2 mm，容积约为5 μL。此外，设计的支撑网格起到更有效封接基片和盖片的作用。

图2 四通道毛细管电泳芯片结构示意图

2.3 CCD驱动电路及系统软件设计

电荷耦合器件在光电检测领域内的应用非常广泛，为保证其在检测过程中的测量精度、速度及抗干扰能力，有两个主要问题需要解决：提供正常工作所需的时序驱动信号及对输出信号进行处理。因此，CCD驱动电路设计包括电源电路、时序驱动电路及输出信号调整电路的设计[7-9]。此外，为了对CCD器件的光积分时间进行控制，还设计了4个光积分时间控制输入端口。

根据系统功能的具体实现，软件的设计主要包括上位机程序(PC机端USB设备的驱动及相应的检测控制程序)和下位机程序(8051增强型单片机固件程序，以及保证芯片FX2模块工作在Slave FIFO模式下的FPGA实现)。FPGA程序设计使用Verilog HDL语言实现，在QUARTUS Ⅱ9.0平台上完成程序的综合、实现及下载，使用ModelSim软件进行仿真。数据采集程序在开发过程中使用微软公司提供的Microsoft Function Class集成开发库，主要实现向下位机发送命令，并负责接收下位机发送的数据，处理后实时绘制出检测结果。

2.4 芯片电泳条件

每次电泳实验前，分别使用1 mol/L的NaOH溶液、去离子水和缓冲溶液清洗毛细管电泳芯片微通道。实验过程中使用如图3所示的电动进样模式进行荧光染色剂罗丹明B样品的进样，图中B表示缓冲液池(Buffer reservoir),S表示样品池(Sample reservoir),D表示检测区域(Detection area),SW表示样品废液池(Sample waste reservoir)。进行电泳操作前，首先取适量罗丹明B储备液稀释在无水乙醇中，配制成一定浓度的样品溶液，然后将缓冲液和样品加入各自的储液池中。进样阶段，样品从样品池(600 V)迁移至样品废液池，缓冲液池和缓冲废液池的电压分别为400 V和600 V，样品废液池电极接地。进样30 s后，高压电源切换，十字交叉口处的样品从进样通道进入分离通道进行分离及检测，此时缓冲液池施加800 V电压，样品池和样品废液池电压均为600 V，缓冲废液池电极接地。每次电泳操作结束后，立即用去离子水清洗芯片微通道，以免缓冲溶液水分蒸发堵塞通道。

图3 毛细管电泳芯片电动进样和分离过程示意图

3 测试结果与讨论

3.1 LED光源的稳定性

为了检测LED光源的特性，在测试过程中使LED的驱动电压每3 min变化一次，变化范围从3.0～4.2 V，步长为0.2 V，用以考察LED的驱动电压对其发光强度及稳定性的影响。LED驱动电压与发光强度之间的关系如图4所示，可以看出发光强度与驱动电压具有良好的线性关系，当驱动电压恒定时光强稳定。当驱动电压达到4.2 V时，LED的发光强度在3 min内急速地下降，这很大程度上是由于LED器件内部阴极与阳极间的工作电流已经超过它的上限，多余的焦耳热导致了不可避免的器件损坏。因此，在后续的实验中，LED的驱动电压恒定设置为4.0 V。

图4 LED光源驱动电压与其发光强度之间的关系

3.2 偏振隔离程度对检测结果的影响

该文利用NT-66182型线性玻璃偏振片进行了偏振隔离程度的检测，其在波长400 ～ 700 nm时的消光系数为10 000:1，两偏振片平行放置时透光率为11%，垂直放置时为0.000 22%。实验过程中，保持LED驱动电压为4.0 V不变，偏振片1固定，使偏振片2的偏振角度从0°依次旋转至360°，检测结果如图5所示。图中的横轴为两偏振片之间的相对偏振角度，纵轴为透射的荧光信号相对强度，两者呈余弦函数关系。由测试结果可以看出：采用偏振方向相互垂直的两线性玻璃偏振片，可以将入射光完全滤除掉，使通过针孔到达光电转换器件的信号只包含有用的荧光信号，提高了检测系统的信噪比。

图5 激发光相对光强与两偏振片之间相对偏振角度的关系

3.3 针孔的滤波效果

为了进一步提高系统的信噪比，降低噪声信号对有用荧光信号的干扰，考虑在光电转换器件前端放置针孔。为考察针孔直径对检测结果的影响，3种不同尺寸(直径分别为0.5 mm、1 mm、2 mm)的针孔被置于CCD检测器和偏振片2之间，LED的驱动电压为4.0 V，两偏振片间的偏振角度为90°。图6给出了1 mmol/L的罗丹明B样品溶液注入毛细管电泳芯片同一通道时，在3种不同尺寸针孔下的检测结果。

图6 不同针孔直径对系统检测结果的影响

从图中可以看出，检测到的荧光信号强度随着针孔尺寸的增大而增强。但是，当针孔的尺寸较大时，其检测到的荧光信号的谱峰宽度也较大，若此时被分离的样品溶液含有多种组分，则不同组分的检测峰有可能相互交叠，其中半峰宽较窄的波峰会被半峰宽较宽的波峰覆盖，进而导致无法准确判断样品的组成。由图中还可以看出，如果针孔直径较小(0.5 mm)，样品浓度较低时(1 μmol/L)荧光信号会很弱，甚至有可能检测不到波峰，因此，检测系统中针孔的直径选定为1 mm。

3.4 检测系统的性能

将4种不同浓度的罗丹明B样品溶液(从1 mmol/L到1 μmol/L)分别注入毛细管电泳芯片的4条微通道，利用组建好的检测系统进行电泳分离实验。其中，进样电压和分离电压分别为600 V和800 V。实验条件为：LED驱动电压为4.0 V，两偏振片间的偏振角度为90°，针孔直径为1 mm。得到的检测结果如图7所示，图中的4条曲线从左至右分别代表4种浓度由小到大的样品溶液电泳分离时检测到的荧光信号强度，浓度越大，荧光信号越强。

图7 4种不同浓度罗丹明B样品溶液在优化条件下的电泳分离结果

4 结束语

4 机械壳设计

由于在高压环境进行测试，电路板放置在机械封装中，机械壳体采用全封闭组合电器用耐压壳体，与外界的高压环境隔绝，因此在壳体内部的电路板仍然处于常压状态，外部的冲击对电路板的性能以及其他的影响基本为0,所以在常压下对电路板进行的标定是完全可以被用在高压环境中的。装置壳体尺寸是≤50 mm×100 mm的圆柱体，壳体设计为圆柱壳体较立方壳体有以下优点：体积利用率高；相同材料下，圆柱壳体比立方壳体强度高；圆柱壳体360°对称，而立方壳体每条棱和棱角处易出现应力集中，使壳体变形或损坏。

5 结束语

本文中所介绍的小型高速采集系统装置具有体积小可内置的特性，在有限的体积、重量等设计约束下，实现了降低功耗，高性能，长使用时间的设计目标，壳体达到了高压条件下对系统的耐压防漏要求，系统采集精度可达到±1.9 mV,速度可达500 MSPS,经过测试得出系统比较稳定，使用方便，能够满足设计和使用的要求。

[1] 王强,文丰,任勇峰，等.基于FPGA的高速实时数据采集存储系统.仪表技术与传感器,2009(1):50-52.

[2] 孙来敏.基于FPGA的高速图像采集系统的设计与研究：[学位论文].济南：山东师范大学,2010.

[3] 中国科学院长春光学精密机械与物理研究所.一种高速数字信号采集、存储系统:中国,CN201310140484.5.2013-08-14.

[4] 熊小民,古江汉,王丹林，等.正确认识示波器探头.玉林师范学院学报,2006,27(3):57-60.

[5] 许烈华.一种高效高速采集存储系统设计.电讯技术,2013(6):763-767.

[6] 张华,胡修林,马若飞，等.超高速数据采集系统设计与优化策略研究.2010年全国工业控制计算机技术年会，杭州，2010.

[7] 何亓,张会新,刘波，等.基于FPGA的高速实时数据采集存储系统设计.仪表技术与传感器,2011(8):64-66,93.

[8] 赵乐.基于FPGA的高速实时数据采集存储系统的设计：[学位论文].武汉：武汉理工大学,2012.

Vertical Multi-Layer LED-Induced Fluorescence Detection System

YANG Xiao-bo1,2,YAN Wei-ping2

(1.College of Electrical Engineering,Xuchang University,Xuchang 461000,China;2.School of Electronic Science and Technology,Dalian University of Technology,Dalian 116024,China)

A cross-polarization scheme and vertical multi-layer structure was presented to filter out the excitation light from the emission spectrum of fluorescent dyes using green light emitting diodes as a light source and a linear charge coupled device as an intensity detector in order to decrease detection limit of the system.The detection system was composed of light emitting diode light source,two polarizers,capillary array electrophoresis microchip,pinhole,charge coupled device,high-voltage power supply,data acquisition card and data processing unit.Under optimal conditions,capillary electrophoresis separation test of Rhodamine B dye sample was conducted.

vertical multi-layer structure;capillary electrophoresis microchip;fluorescence detection;polarizer

河南省科技厅基础与前沿技术研究计划项目(132300410091)；河南省教育厅科学技术研究重点项目(13B510240)

2014-03-23 收修改稿日期：2014-10-05

TN29

A

1002-1841(2015)03-0066-03

姚琴琴(1989—)，硕士研究生，主要从事动态测试与智能仪器的研究。E-mail:15035168176@163.com