细胞角蛋白19mRNA检测在大肠癌患者外周血转移检测中的应用

李记彬　胡秀芬　刘放　宋纯

[摘要]目的：研究细胞角蛋白19mRNA检测在大肠癌（CRC）患者外周血转移诊断中的应用价值。方法：选取我院2011年2月至2014年3月大肠癌患者共计126例进行RT-PCR检测，另选40例大肠良性疾病患者与40例健康献血者进行对照，采取荧光定量逆转录一聚合酶链反应（FQ-RT-PCR）测定其CK19mRNA含量。并分析CK19mRNA在肿瘤回流血中的表达。结果：40例健康者1例CK19mRNA阳性表达，40例结肠良性疾病患者均为阴性；126例患者CKl9阳性例数74例，阳性表达率为58.73%，与健康组和良性组比较有显著统计学意义（P<0.05）；CK19阳性表达与性别、年龄、细胞分化类型无明显相关（P>0.05），与淋巴结转移有明显相关性（P<0.05），同时Dukes分期C、D期患者阳性检出率明显高于A、B期患者（P<0.05）。结论：CKl9mRNA检测应用于大肠癌患者外周血转移诊断有较高的价值，可以为肿瘤转移和复发诊断提供重要依据。

[关键词]细胞角蛋白19；大肠癌；外周血转移；应用

中图分类号：R735.3 文献标识码：A 文章编号：2095-5200（2015）01-055-02

细胞角蛋白（CK）属于多基因家族，包含有20多个不同亚类分子，主要表达集中在上皮细胞，同时可以不断分泌进入到外周血中，因此可以将外周血特异性上皮性基因的异常表达作为检测上皮性恶性肿瘤细胞的重要指标。CK20mRNA已成为膀胱癌、乳腺癌、大肠癌的血行转移依据，本次研究主要围绕大肠癌患者外周血转移诊断中CK19mRNA的表达，分析其对大肠癌转移诊断的临床意义。

1.资料与方法

1.1一般资料

研究选取的126例大肠癌患者均为2011年2月至2014年3月在我院接受住院治疗的病例，其中男性占84例，女性42例，年龄范围32～84岁，平均年龄（57.9±3.2）岁，Dukes分期：A期30例、B期26例、C期48例、D期22例；细胞分化程度：高分化36例、中分化64例、低分化26例；组织学类型：结肠癌72例，直肠癌52例。同时选取40例健康献血者（健康组）和40例结肠良性疾病患者（良性疾病组）进行对比。健康组：男性20例，女性20例，年龄范围29-70岁，平均年龄（48.7±3.3）岁；良性疾病组：男性20例，女性20例，年龄范围30-72岁，平均年龄（50.1±2.9）岁。三组患者性别、年龄等基线资料差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。

1.2一般方法

1.2.1RNA提取 分别抽取大肠癌患者、健康志愿者及结肠良性疾病患者外周静脉血5mL，并采用枸橼酸钠抗凝，对单个核细胞采取淋巴细胞分离液进行分离，保存到离心管，持续5min离心每分钟12000r，然后将Trizol lmL加入并使其均匀，后加200μL氯仿并混匀，离心15min，每分钟12000r，吸取上清放置到离心管中加入500μL异丙醇混合均匀，离心10min，每分钟12000r，然后使用75%乙醇进行1次漂洗，放置待干，添入DEPC水30μL，对RNA进行溶解，同时依靠紫外分光光度计对RNA的纯度以及浓度进行测定。

1.2.2逆转录合成cDNA与PCR扩增 取总RNA于70℃变性5min后沐浴，根据每个反应将RT反应液18μL逆转录酶（M-MLV）1μL（5U/μL），RNA酶抑制剂（RNasin）1μL（40U/μL），将变性RNA5μL加入，水浴30min，温度37℃，95℃变性5min。PCR扩增根据每个反应将43μL反应液加入，Taq酶2μL（5U/μL），RT反应产物5μL。反应条件：预变性为95℃ 5min，95℃ 30s，62℃ 20s，72℃ 20s，40个循环。72%延伸10min。同时以标准eDNA为阳性对照，无菌水为阴性对照。

1.3统计学方法

采用x2检验，P<0.05时有统计学意义。

2.结果

2.1健康组、结肠良性组外周血CK19mRNA表达

40例健康者1例CK19mRNA阳性表达，40例结肠良性疾病患者均为阴性。

2.2大肠癌组外周血CK19mRNA表达

126例患者CK19阳性例数74例，阳性表达率为58.73%，与健康组和良性组比较有显著统计学意义（P<0.05）。

2.3CK19 mRNA阳性表达与临床病理参数的相关性

CRC中CK19 mRNA阳性表达与性别、年龄、细胞分化类型无明显相关（P>0.05），阳性率与Dukes分期，分化程度及淋巴结转移有关（P<0.05）见表1。

3.讨论

大肠癌患者死亡的主要原因是大肠癌发生转移和复发，而尽早对大肠癌转移进行诊断是关键所在。CKl9在肿瘤发生及转移中发挥了重要作用，目前已成为研究热点。肿瘤细胞从原发灶脱落是血液循环开始出现转移的先兆，当肿瘤原发灶开始成熟后，肿瘤细胞才会开始转移进入到外周血当中，人体免疫系统能够清除大多数的细胞，但是仍会有少量残留恶性肿瘤细胞集合成为癌细胞团，最终产生转移灶，循环血中的肿瘤细胞数量不多，因此需要高特异性和敏感度的检测方式。PCR技术很好地解决了这一问题。RT-PCR可在106-107个正常细胞中检测出癌细胞，目前在众多肿瘤标志物的研究中均有广泛的应用。FQ-RT-PCR是在RT-PCR基础上发展而来的mRNA定量方法，具有灵敏度、特异性高、效率高、污染小等优势。

本研究应用PCR技术检测外周血中CK19表达，结果健康体检者中出现1例阳性表达者，原因有待进一步研究，良性组均无阳性表达。显示126例外周血CK19mRNA阳性检出率为58.73%。相关性分析可见Dukes分期及淋巴结转移与外周血中CK19表达率相关。C、D期的阳性检出率明显高于A、B期，提示C、D期大肠癌预后不良，并存在较高的转移风险。

综上所述，CK19 mRNA在CRC发生发展中具有重要作用。CK19mRNA检测应用于CRC患者外周血转移诊断有较高的价值，可以为肿瘤细胞的转移和复发提供重要诊断依据。