牛精蛋白的纯化及抑菌效果研究

刘亚娜,李儒仁,安迈瑞,余群力,*,于春起,韩广星

(1.甘肃农业大学食品科学与工程学院,甘肃兰州 730070;2.河北三河五丰食品有限公司,河北三河 065200;3.山东绿润食品有限公司,山东临沂 276000)

牛精蛋白的纯化及抑菌效果研究

刘亚娜1,李儒仁1,安迈瑞1,余群力1,*,于春起2,韩广星3

(1.甘肃农业大学食品科学与工程学院,甘肃兰州 730070;2.河北三河五丰食品有限公司,河北三河 065200;3.山东绿润食品有限公司,山东临沂 276000)

以牛睾丸为原料研究牛精蛋白纯化工艺及抑菌性能,以提高牛精蛋白抑菌能力和牛副产物利用率。牛睾丸经5.48%硫酸溶液超声波辅助提取,95%冷乙醇沉淀,丙酮、乙醚洗涤后得牛精蛋白粗品。采用阳离子交换层析(SP-Sepharose Fast Flow)和凝胶过滤层析(Sephacryl S-100)对牛精蛋白粗品进行纯化,纯化后的牛精蛋白得率为3.92%。经SDS-PAGE分析，牛精蛋白分子量为19ku。以新鲜牛肉、酱牛肉、新鲜豆干和酱豆干为抑菌对象,发现纯化牛精蛋白溶液处理的菌落总数极显著小于粗提牛精蛋白溶液处理的菌落总数(p<0.01),且分别降低了86.44%、85.77%、83.39%和89.82%。纯化后的牛精蛋白具有很强的抑菌能力,是一种良好的天然食品防腐剂。

牛睾丸,精蛋白,纯化,抑菌

精蛋白(Protamine)是一种广泛存在于各类雄性动物成熟精巢组织中的多聚阳离子肽,氨基酸组成中2/3以上是精氨酸[1]。精蛋白在食品、医药、保健品等领域均有广泛应用,尤其在食品加工业中,由于其抑菌谱广、热稳定性好、安全无副作用等特点,在天然食品防腐剂使用方面具有广阔前景。

目前,市场上主要的食品防腐剂有化学防腐剂和天然防腐剂两大类,其中天然食品防腐剂由于其安全无毒、抑菌性强及作用范围广而受到广泛青睐。精蛋白作为一种新型天然食品防腐剂而成为研究热点,相关研究主要集中在从鱼类精巢组织中提取鱼精蛋白,并对其营养成分和功能进行分析。如Tom A. Gill等人[1]以鲱鱼为原料,采用硫酸或盐酸优化鲱鱼精蛋白提取工艺,结果表明,用盐酸和硫酸提取鲱鱼精蛋白的得率分别为1.1%和1.5%。刘红玉等人[2]以大马哈鱼为原料,对其精蛋白提取工艺进行筛选,最终分离得到具有较强抑菌活性的大马哈鱼精蛋白。从哺乳动物精巢中分离精蛋白的研究仅在双驼峰中有报道,实验提取的双峰驼精蛋白活性较高,其大小在15～18ku,且对金色葡萄球菌有明显抑菌效果[3]。然而,有关牛精蛋白的研究报道甚少。我国肉牛资源丰富,牛睾丸作为其副产物之一,来源广泛,价格低廉,但利用率低[5]。因此,提高牛精蛋白的纯度并研究其抑菌性能,对天然食品防腐剂的开发和牛副产物资源的利用具有重要意义。

本研究以牛睾丸为原料提取牛精蛋白,并对牛精蛋白进行抑菌实验,为天然食品防腐剂开发利用奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

新鲜牛睾丸 河北三河五丰食品有限公司、山东绿润食品有限公司,用水清洗后除去附着在睾丸上的脂肪、结缔组织、血块和污物等,将处理过的样品于-80℃下冻藏待用;新鲜牛肉、新鲜豆干 北京华联超市。

SP-Sepharose Fast Flow、Sephacryl S-100 General Electric Company;牛血清白蛋白 Sigma;丙烯酰胺、双丙烯酰胺、三羟甲基氨基甲烷、过硫酸铵、十二烷基磺酸钠(SDS)、四甲基乙二胺、DTT、α-巯基乙醇,均为国产电泳级;其它试剂均为国产分析纯。

JY92-ⅡDN超声波细胞破碎仪 宁波新芝生物科技股份有限公司;TGL-16M型台式高速冷冻离心机 湘仪离心机仪器有限公司;AL204型电子天平 梅特勒-托利多仪器公司;SP-756P型紫外可见分光光度计 上海光谱仪器有限公司;PPS-2蛋白纯化系统 上海金达生化仪器有限公司。

1.2 牛精蛋白粗品提取工艺

本工艺参考文献[7]。

1.2.1 主要工艺流程 牛睾丸→组织捣碎→离心→收集沉淀→提取→离心→过滤上清液→冰浴沉淀→离心→收集沉淀→洗涤→真空干燥→牛精蛋白粗品

1.2.2 操作方法 称取100g解冻的牛睾丸,置于高速组织捣碎机中,加入200mL 0.14mol/L NaCl溶液匀浆1min,冰浴搅拌20min后静置10min。离心(4000r/min,0℃,10min),弃去上清液。在沉淀中加入5.48%硫酸溶液,超声波(188.54W)辅助提取10min,离心(4000r/min,0℃,10min),将上清液过滤,所得沉淀再重复提取1次,将滤液合并。加入95%冷乙醇冰浴沉淀30min,离心(8000r/min,0℃,10min),所得沉淀用丙酮洗涤2次,乙醚洗涤1次后真空干燥,得牛精蛋白粗品。

1.3 牛精蛋白纯化工艺

1.3.1 SP-Sepharose Fast Flow离子交换层析 根据文献[8-10]，填料活化装柱后,依次使用蒸馏水和缓冲液A(pH9.0 25mmol/L甘氨酸-氢氧化钠)平衡。设置缓冲液A为副通道,B(1.0mol/L NaCl溶液)为主通道,流速为1.0mL/min。将牛精蛋白粗品溶解于缓冲液A,采用进样泵自动进样后梯度洗脱。根据紫外检测值所显示的峰型收集样品,每管收集3.0mL。测定每管收集样品的蛋白含量,并将全部有抑菌活性的样液混合浓缩以备凝胶过滤层析使用。

1.3.2 Sephacryl S-100凝胶过滤层析 根据文献[11-13]，填料活化装柱后,分别使用蒸馏水和缓冲液C(pH5.4 25mmol/L乙酸-乙酸钠)平衡。设置流速为0.2mL/min。采用手动方式进样,待样品完全进入填料后用缓冲液C洗脱。根据紫外检测值所显示的峰型开始收集样品,每管收集3.0mL。测定每管收集样品的蛋白含量,并将全部有抑菌活性的样液混合浓缩以备后期实验使用。

1.4 牛精蛋白含量及蛋白得率的测定

牛精蛋白含量采用考马斯亮蓝蛋白质含量测定法[14]。

离子交换层析或凝胶过滤层析后,分别将全部有抑菌活性的样液混合浓缩,真空干燥。

式中,m1为真空干燥后的蛋白质量;m2为牛睾丸样品的质量。

1.5 SDS-PAGE

将得到的纯化牛精蛋白进行不连续SDS-PAGE,浓缩胶浓度为5%,分离胶为12%,电泳缓冲液为pH 8.3的Tris-Gly(三羟甲基氨基甲烷-甘氨酸),蛋白染色为考马斯亮蓝R250溶液,脱色至条带清晰可见后拍照。以标准蛋白marker为对照,确定牛精蛋白分子量。

1.6 牛精蛋白的抑菌实验

1.6.1 供试样品 供试样品Ⅰ:新鲜牛肉。

供试样品Ⅱ:酱牛肉。将牛肉切块后,加入佐料及适量水,文火酱制3h,制成酱牛肉。

供试样品Ⅲ:新鲜豆干。

供试样品Ⅳ:酱豆干。在新鲜豆干中加入佐料及适量水,文火酱制3h,制成酱豆干。

1.6.2 样品处理 每种样品各称取三份,每份20g。配制浓度5%的粗提牛精蛋白溶液(X)和纯化牛精蛋白溶液(Y)各200mL,无菌水作对照。将样品分别在三组溶液中浸泡1min后沥干,于室温下保藏24h。加入100mL无菌水,匀浆后加倍递增稀释。分别吸取1.0mL 10-4和10-5级稀释液置于已灭菌的培养皿中,倒琼脂平板,于37℃培养24h后,计算菌落总数[9]。实验重复三次。

1.7 数据处理

使用Microsoft Excel 2007和SPSS 19.0进行数据处理及分析。

2 结果与分析

2.1 牛精蛋白含量测定的标准曲线

灰白色细砂岩，棕红色、棕黄色泥岩不等厚互层，砂岩钙质胶结，泥岩呈块状。中细砂岩主要为灰白色，较致密，主要矿物成分为石英、长石。结构密实，孔隙接触式胶结，含有较多灰岩颗粒，有灰黑色灰岩颗粒。泥岩为棕红色、棕褐色、棕黄色泥岩，呈块状，坚硬断面，吸水，含有白色石膏颗粒。细砂岩：主要为灰白色，较致密；成分为石英、长石；结构密实，孔隙接触式胶结，有部分钙质胶结，有白色石膏颗粒，有灰黑色灰岩颗粒。该地层据测井解释成果反映，共有31层砂岩，砂岩总厚度为43.4 m，砂厚比为14.42%，单层厚度最大为2.6 m，最薄为0.6 m。

以牛血清白蛋白为标品做标准曲线,如图1所示:

图1 牛血清白蛋白标准曲线Fig.1 Standard curve of the BSA

由图1可知,标准曲线方程为:y=5.8171x+0.0065,式中,y为吸光度值;x为牛血清白蛋白浓度,单位mg/mL,R2=0.9984。

2.2 牛精蛋白的分离纯化

2.2.1 SP-Sepharose Fast Flow离子交换层析 由图2知,样品经SP-Sepharose Fast Flow离子交换层析分离纯化后先后得到三个蛋白峰。经抑菌活性实验验证,其中第一个洗脱峰为杂蛋白峰,此时混合洗脱液中不含NaCl;第二个洗脱峰为活性峰,即具有抑菌活性的牛精蛋白位于第23～31管,NaCl浓度为0.15～0.25mol/L;第三个洗脱峰也为杂蛋白峰,NaCl浓度为0.25～0.35mol/L。此结果说明牛精蛋白粗提液经SP-Sepharose Fast Flow离子交换层析后得到初步分离,且3个组分于含有不同NaCl浓度的洗脱液中被洗脱出来,这是由于离子强度梯度对混合洗脱液中不同组分与SP-Sepharose Fast Flow的电荷吸附能力存在差异所造成。纯化所得牛精蛋白得率为4.21%。将全部有抑菌活性的几管溶液收集并浓缩,准备下一步纯化。

表1 菌落总数计数结果(cfu/mL)Table 1 Total number of colony on studied samples(cfu/mL)

图2 SP-Sepharose Fast Flow离子交换层析洗脱曲线Fig.2 Elution curve of SP-Sepharose Fast Flow

注:同行不同大写字母表示差异极显著(p<0.01),同列不同小写字母表示差异显著(p<0.05)。2.2.2 Sephacryl S-100凝胶过滤层析

由图3知,样品经Sephacryl S-100凝胶过滤层析分离纯化后先后得到三个蛋白峰。经抑菌活性检测,活性峰处于第二个和第三个洗脱峰中间,即具有抑菌活性的牛精蛋白溶液位于第28～43管。牛精蛋白峰出现较晚,可能是由于牛精蛋白在被纯化的样品中属于分子量较小的蛋白。经过两步纯化后牛精蛋白得率为3.92%,与SP-Sepharose Fast Flow离子交换层析相比,得率降低0.29%。

图3 Sephacryl S-100凝胶过滤层析洗脱曲线Fig.3 Elution curve of Sephacryl S-100

2.3 SDS-PAGE分析

图4 牛精蛋白的SDS-PAGE图谱Fig.4 SDS-PAGE of bovine protamine注:M-标准蛋白;1-粗品;2-纯化后的牛精蛋白。

由SDS-PAGE图谱可知,纯化后的牛精蛋白图谱呈现单一的蛋白条带,表明分离纯化得到的牛精蛋白纯度较高,其分子量约为19ku。由已有报道知,鲢鱼精蛋白纯品的分子量约为13ku[6];鲤鱼精蛋白分子量约为3ku[9];双峰驼精蛋白的分子量在15～18ku间[3]。相较于鱼精蛋白的分子量,牛精蛋白的分子量较大,但与双峰驼精蛋白的分子量相近,这可能是原料本身存在差异所造成。SDS-PAGE图谱结果还表明,纯化时所选填料具有良好的色谱性能,将其应用于牛精蛋白的分离纯化,取得了较好的纯化效果。

2.4 抑菌实验

将牛精蛋白溶液应用于牛肉和豆干的防腐,观察对样品中腐败菌的抑制效果,其菌落总数计数结果见表1。

由表1知,室温条件下,分别经粗提牛精蛋白溶液(X)、纯化牛精蛋白溶液(Y)、蒸馏水处理的新鲜牛肉、酱牛肉、新鲜豆干及酱豆干,菌落总数差异极显著(p<0.01),具体表现为对照组极显著大于X处理组,X处理组极显著大于Y处理组。样品经Y处理后的菌落总数,与X处理组相比,新鲜牛肉、酱牛肉、新鲜豆干、酱豆干分别降低了86.44%、85.77%、83.39%和89.82%。由此可知,纯化牛精蛋白比粗提牛精蛋白对牛肉和豆干样品中腐败菌的抑制作用更强,也说明牛精蛋白抑菌性能强,作为天然食品防腐剂使用的潜力巨大。

经过牛精蛋白溶液处理,牛肉和豆干样品中的菌落总数存在显著性差异(p<0.05),这可能是样品本身存在差异所造成。本抑菌实验所选的样品(牛肉和豆干)均为日常食用品,营养丰富,具有一定的代表性。实验结果证实了牛精蛋白较好的抑菌性能,与已有报道中精蛋白抗菌特性结果相吻合[3,9]。

3 结论

3.1 经离子交换层析(SP-Sepharose Fast Flow)和凝胶过滤层析(Sephacryl S-100)分离纯化,牛精蛋白得率分别为4.21%和3.92%。

3.2 纯化后的牛精蛋白SDS-PAGE图谱呈现单一的蛋白条带,分子量约为19ku。

3.3 纯化牛精蛋白溶液处理的新鲜牛肉、酱牛肉、新鲜豆干及酱豆干,菌落总数均极显著小于粗提牛精蛋白溶液处理组(p<0.01),且分别降低了86.44%、85.77%、83.39%和89.82%,纯化后的牛精蛋白溶液抑菌能力大幅提高,抑菌性能强。

[1]Gill T A,Singer D S,Thompson J W. Purification and analysis of protamine[J]. Process Biochemistry,2006,41(8):1875-1882.

[2]刘红玉,姜学芬,崔洪斌.大马哈鱼鱼精蛋白的提取及抑菌作用的研究[J].食品科学,2007,28(2):37-39.

[3]蒙学莲,郑亚东,李辉,等.双峰驼精蛋白的提取及其抑菌特性的初探[J].畜牧与兽医,2008,40(6):65-67.

[4]Chase H P,Dixon B,Pearson J,etal. Reduced hypoglycemic

episodes and improved glycemic control in children with type 1 diabetes using insulin glargine and neutral protamine Hagedom insulin[J]. The Journal of Pediatrics,2003,143(6):737-740.

[5]郭兆斌,余群力.牛副产物——脏器的开发利用现状[J].肉类研究,2011,25(3):35-37.

[6]谢俊杰,李华栋.鲢鱼(Aristichthysnobilis)鱼精蛋白的纯化和鉴定[J].江西科学,2001,19(4):214-217.

[7]李若绮,韩玲,李儒仁,等.超声波辅助提取牛睾丸中精蛋白工艺优化[J].食品工业科技,2014,35(16):212-216.

[8]Liu J,Du L Y,Zhao Z H,etal. Studies on protamine purification by surfactant precipitation[J]. Journal of Biotechnology,2008,136:S501-S502.

[9]上官新晨.鲤鱼抗菌精蛋白的提取、分离、抗菌特性研究及抗菌机理探讨[D].西安:陕西师范大学,2004:33-38.

[10]Yang C,Zhou J,Gong B. Reparation of weak cation exchange packing based on macroporous monodisperse hydrophilic resins and their application for the separation and purification of protamine[J]. Se Pu,2009,27(2):191-196.

[11]Pugsley M K,Kalra V. Protamine is a low molecular weight polycationic amine that produces actions on cardiac muscle[J]. Life Sciences,2002,72(3):293-305.

[12]Luo F,Rong G. Isolation and characterization of a hyaluronidase from the venom of Chinese red scorpionButhusmartensi[J]. Comparative Biochemistry and Physiology,2008,148(3):250-257.

[13]Bordon K C F,Perino M G,Giglio J R,etal. Isolation,enzymatic characterization and antiedematogenic activity of the first reported rattlesnake hyaluronidase from Crotalus durissus terrificus venom[J]. Biochemistry,2012,94(12):2740-2748.

[14]Chan J K,Thompson J W,Gill T A. Quantitative determination of protamines by coomassie blue G assay[J]. Analytical Biochemistry,1995,226(1):191-193.

Research of purification and antibacterial effect of bovine protamine

LIU Ya-na1,LI Ru-ren1,AN Mai-rui1,YU Qun-li1,*,YU Chun-qi2,HAN Guang-xing3

(1.College of Food Science and Engineering,Gansu Agricultural University,Lanzhou 730070,China;2.Hebei Sanhe Wellful Food Company,Sanhe 065200,China;3.Shandong Lorain Food Company,Linyi 276000,China)

The purification process and antimicrobial activity of bovine protamine extracted from bovine testis were studied,for purpose of improving purity and utilization of bovine protamine. Crude bovine protamine was gained by ultrasonic-assisted extracting with 5.48% sulfuric acid solution,precipitating with 95% cold ethanol,washing with acetone,ether. Bovine protamine was purified by SP-Sepharose Fast Flow ion exchange chromatography and Sephacryl S-100 gel filtration chromatography,and the yield was 3.92%. The molecular weight was 19ku analyzed by SDS-PAGE. The result of antibacterial test indicated the total number of colonies of fresh beef,sauced beef,fresh bean curd and sauced bean curd dealt with bovine protamine purified were greatly significant less than them dealt with crude bovine protamine(p<0.01),and respectively decreased 86.44%,85.77%,83.39%,89.82%. Bovine protamine purified had strong antimicrobial activity,which showed bovine protamine was a well natural food preservative.

bovine testes;protamine;purification;antimicrobial

2014-03-25

刘亚娜(1989-)，女，硕士研究生，研究方向:畜产品加工。

*通讯作者:余群力(1962-)，男，博士，教授，主要从事畜产品贮藏加工研究。

国家现代农业产业技术体系资助(CARS-38)；公益性行业(农业)科研专项(201203009)。

TS251.9

A

1002-0306(2015)01-0066-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.01.005