非家族性青年三阴性乳腺癌与BRCA1基因突变的关系

刘晓丹，许文婷，杨 亮，吴 涛，王 斌，吐鲁洪·沙吾列，赵 倩，迪力夏提·金斯汗，朱丽萍

非家族性青年三阴性乳腺癌与BRCA1基因突变的关系

刘晓丹，许文婷，杨 亮，吴 涛，王 斌，吐鲁洪·沙吾列，赵 倩，迪力夏提·金斯汗，朱丽萍

目的探讨非家族性青年三阴性乳腺癌（TNBC）与BRCA1基因突变的关系以及突变者与未突变者的临床病理组织特征的差别。方法应用PCR扩增联合DNA直接测序法检测新疆地区50例非家族性青年TNBC患者BRCA1基因突变情况，同时对比分析突变者与未突变者的临床病理组织特征。结果①50例非家族性青年TNBC患者BRCA1突变率为26%（13／50），其中汉族高于少数民族（27.6%vs 23.8%），但差异无统计学意义（χ2＝1.599）。②50例非家族性青年TNBC患者中发现13例BRCA1突变的12个位点，其中4个为新发现的位点；2个BRCA1基因突变“热点”；③50例非家族性青年TNBC BRCA1突变者与未突变者相比，腋窝淋巴结转移率高（69.2%vs35.1%），TNM分期晚（77%vs37.8%），差异均有统计学意义（P＜0.05）。结论新疆地区非家族性青年TNBC患者BRCA1基因突变率高；212＋1G＞T和2077G＞A可能为新疆地区非家族性青年TNBC患者遗传易感位点，尚需扩大样本进一步研究；突变者与未突变者相比，存在临床病理组织差异。

BRCA1基因；突变；非家族性；青年女性；三阴性乳腺癌；临床病理特征

BRCA1基因是重要的抑癌基因，其结构和功能的异常与乳腺癌的发生密切相关［1］。研究［2］表明，BRCA1基因具有显性遗传特性，约45%的家族性乳腺癌中检测出BRCA1基因突变。近年来，随着乳腺癌发病率的增加，发病年龄日趋年轻化，青年乳腺癌在临床上已不少见。三阴性乳腺癌（triple negative breast cancer，TNBC）因受体均为阴性，治疗手段较单一，疗效不佳。这类乳腺癌侵袭性高，组织学分级较高，局部复发和全身转移快，死亡率高［3］。青年TNBC患者预后较差。近年来国内外对于家族性及青年性乳腺癌已有报道，但对于非家族性青年TNBC鲜有报道，因此主要以新疆地区非家族性青年TNBC患者（≤40岁）为研究对象，分析BRCA1突变情况，探讨BRCA1与非家族性青年TNBC的关系。

1 材料与方法

1.1 病例资料收集2012年4月～2014年1月新疆医科大学附属肿瘤医院乳腺外科收治的经病理确诊、符合TNBC标准的青年女性乳腺癌患者50例，其中汉族29例，少数民族21例；患者发病年龄26～40岁，中位发病年龄34岁。均首次诊断为原发性乳腺癌，既往无其他肿瘤史，无化疗、放疗史，排除妊娠期、哺乳期乳腺癌。按BRCA1基因突变与否分为BRCA1基因突变组（n＝13）与BRCA1基因未突变组（n＝37），获得知情同意后抽取外周静脉血，置入5.0 ml含EDTA-K2抗凝的真空采血管中，放入－80℃冰箱中保存。该研究已获得新疆医科大学附属肿瘤医院伦理委员会批准，入组患者均已签署BRCA1基因检测知情同意书。

1.2 主要试剂与器材血液基因组DNA提取系统（非离心柱型）、Super Pure dNTPMix、Pfu DNA Polymerase（北京天根公司）；Marker DL2000、6×Loading Buffer（大连TaKaRa公司）；琼脂糖、50×TAE（上海生工公司）；核酸蛋白定量仪（北京凯奥公司）；台式离心机（上海安亭科学仪器制造厂）；电泳仪电源、电泳槽（北京市六一仪器厂）；梯度PCR仪（美国Bio-Rad公司）；凝胶成像系统（美国UVP公司）。

1.3 实验方法

1.3.1 基因组DNA提取 使用血液基因组DNA提取系统按试剂盒说明提取DNA，电泳、保存。

1.3.2 PCR扩增 PCR反应体系：dNTPMix（10 mmol／L）0.6μl，10×Pfu Buffer 3μl，Primer F（10 μmol／L）0.6μl，Template 0.6μl，Primer R（10 μmol／L）0.6μl，Pfu DNA Polymerase 0.3μl，ddH2O224.3μl，相对应的DNA为50 ng，总反应体系为30 μl。PCR程序：95℃5 min，95℃30 s，退火温度30 s，72℃60 s，40个循环，然后72℃延伸5 min，4℃保存，引物序列和退火温度见表1。

1.3.3 直接测序与分析 将PCR扩增产物5μl在2.0%琼脂糖凝胶电泳为单一亮条带，取目的片段送至乌鲁木齐欧易生物医学科技有限公司进行正反双向测序，将测序结果与GenBank中的BRCA1标准序列（NM＿007300.3）进行比对，判断有无基因突变，再将突变的位点在乳腺癌信息中心网站数据库（breast cancer information core，BIC）上作对照，判定是致病性突变位点、核苷酸多态性位点还是新发现的突变位点。根据HUGO推荐的规则对碱基插入和丢失进行命名。

表1 部分PCR引物序列和退火温度

1.4 雌激素受体（estrogen receptor，ER）、孕激素受体（p rogesterone recep tor）、人表皮生长因子受体（hum an epiderm al grow th factor-2，HER-2）检测方法及结果判定使用PV9000法对患者进行ER、PR和HER-2表达的检测。ER、PR以细胞核内有棕色颗粒者视为阳性细胞，着色阳性细胞数＞10%视为阳性；Her-2以＞10%细胞膜出现连续性的棕黄色表达视为阳性，10%～30%为（＋），31%～50%为（＋＋），＞50%为（＋＋＋）。对于HER-2（＋＋）者再行荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization，FISH）法检测确定HER-2基因扩增情况。ER、PR、HER-2均为阴性则定义为TNBC，其中任何一项阳性则定义为非TNBC［4］。

1.5 统计学处理采用SPSS 17.0统计软件进行分析，计量资料以±s表示，计数资料以n或%表示，组间率的比较采用χ2检验，危险因素采用二项Logistic回归分析，对各项参数进行赋值。

2 结果

2.1 BRCA1基因突变检测对本组50例非家族性青年TNBC患者BRCA1基因突变进行检测，共发现13例BRCA1突变的12个位点，突变率26%（13／50），包括5例致病性突变（FS、NS）和9例意义不明突变（MS、SP）；其中2个BRCA1基因突变“热点”：5号外显子第212＋1基因拼接点区G＞T和10号外显子2077G＞A；突变位点中有4个位点在BIC中未有报道，为新发现的位点。见表2。非家族性青年TNBC患者BRCA1突变率汉族高于少数民族（27.6%vs23.8%），但差异无统计学意义（χ2＝1.599）。

2.2 BRCA1基因突变临床病理特征本组50例新疆非家族性青年TNBC中，BRCA1基因突变组腋窝淋巴结转移率高于BRCA1基因未突变组（69.2%vs 35.1%），差异有统计学意义（χ2＝4.539，P＜0.05）。BRCA1基因突变组较BRCA1基因未突变组在TNMⅢ、Ⅳ期比例高（77%vs 37.8%），差异有统计学意义（χ2＝8.596，P＜0.05）。BRCA1基因突变组与BRCA1基因未突变组在民族、病理类型、组织学分级、肿瘤大小以及Ki-67之间差异均无统计学意义。见表3。

2.3 BRCA1基因突变组免疫组化及临床病理分期的Logistic回归分析新疆地区50例非家族性青年TNBC患者中13例BRCA1突变组乳腺癌的Logistic分析结果显示：Ki-67＞14%、组织学分化较差、淋巴结转移、浸润性导管癌、TNM分期较晚（Ⅲ、Ⅳ期）的患者发生BRCA1突变的概率分别是Ki-67≤14%、组织学分化较好、淋巴结未转移、非浸润性导管癌、TNM分期较早（Ⅰ、Ⅱ期）患者的2.800、2.183、4.154、0.521、5.476倍。见表4、5。

表2 50例非家族性青年TNBC患者BRCA1突变检测结果

表3 临床病理特征比较［n（%）］

3 讨论

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，发病率逐年上升，在部分大城市已成为女性恶性肿瘤之首位，发病年龄也逐渐年轻化［5］。据国外文献［6］报道，青年乳腺癌占全部乳腺癌的15%～25%。BRCA1基因是与乳腺癌发病高度相关的肿瘤抑癌基因，在高危人群（家族性乳腺癌、TNBC、早发性乳腺癌、双侧乳腺癌等）中BRCA1突变率较高，国内外关于家族性乳腺癌与BRCA1的报道已很多。

表4 观察参数统计赋值表

表5 13例非家族性青年TNBC患者BRCA1基因突变免疫组化及临床病理分期的Logistic回归分析

本研究以50例非家族性青年TNBC患者为研究对象，其BRCA1的突变率为26%（13／50）。国外文献［7］报道，不同的研究人群TNBC中BRCA1突变率约11%～38%。而丁晓曼等［8］检测北京地区10例早发性乳腺癌BRCA1突变率为10%。本研究与国外同类报道［7］基本一致，高于国内同类报道［8］，提示本研究BRCA1基因突变可能与新疆地区非家族性青年TNBC患者密切相关。其中汉族患者BRCA1基因突变率高于少数民族，但差异无统计学意义。本研究中5例BRCA1致病性突变：3例移码突变3294delT、2952delT、2073delA和1例无义突变2394C＞T均位于Exon10，1例移码突变5533＿5540del位于Exon 24。此外发现的9例意义不明突变中5例位于Exon10，2例位于Introns16，2例位于Exon5；其中13号标本Exon10上发现了3个突变位点。本研究显示BRCA1突变大多位于Exon10，这相关文献［9－10］报道基本一致。同时发现2个BRCA1基因突变“热点”：212＋1G＞T位于Exon5，2077G＞A位于Exon10，可能为新疆地区遗传易感位点，尚需扩大样本进一步研究。突变位点中有4个位点（3294delT、2941C＞G、2939T＞A、2073delA均位于Exon10）在BIC中未有报道，为新发现的位点，丰富了中国BRCA1突变携带谱。这些突变可能与新疆地区非家族性青年TNBC患者的地域或种族不同有关系。

本研究中的13例非家族性青年TNBC患者BRCA1基因突变组病理类型多为浸润性导管癌，仅3例髓样癌，与BRCA1基因未突变组相比差异无统计学意义；且组织学分级两组相比差异也无统计学意义，但BRCA1基因突变组青年TNBC患者腋窝淋巴结转移率高，TNM分期晚。这与Levanat et al［11］报道的BRCA1基因突变相关性乳腺癌具有髓样癌及Luminal A亚型比例高、肿瘤细胞分级高等特点不同。而与刘秀兰等［12］报道的结果相一致。BRCA1基因突变者与BRCA1基因未突变者相比，存在临床病理组织差异，应考虑个体化治疗。

本研究通过非条件Logistic回归发现乳腺癌病理和免疫组化特点对BRCA1的突变有影响：Ki-67＞14%、组织学分化较差、淋巴结转移、TNM分期较晚（Ⅲ、Ⅳ期）是BRCA1突变的危险因素。本研究表明，可以通过病理检测肿瘤分化程度和病理免疫组化法来预测BRCA1突变的概率。BRCA1的研究对乳腺癌的病因、预防、诊断和治疗提供有力的支持，但本次研究样本量较少，尚需继续扩大样本量进一步研究。

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The relationship between non-fam ilial young trip le negative breast cancer and BRCA1 mutations

Liu Xiaodan，Xu Wenting，Yang Liang，et al
（Dept of Surgery of Breast，The Affiliated Tumor Hospital of Xinjiang Medical University，Urumqi 830011）

Objective To explore the relationship between non-familial young triple negative breast cancer（TNBC）and BRCA1 gene mutation and discuss the difference of clinical and pathological features between patients with BRCA 1 genemutation and without it.MethodsBRCA 1 genemutationsof5 0 casesnon-familialyoung TNBCpatients were detected by PCR-DNA sequencing in Xinjiang region.Clinical and pathological features were compared and analyzed between patients with BRCA1 gene mutation and without it.Results①The prevalence of BRCA1 mutations in 50 non-familial young TNBC caseswas26%（13／50），which Han is higher than ethnicminorities（27.6%vs23.8%），but the difference was not statistically significant（χ2＝1.599）.②13 cases of BRCA1 mutationswith 12 loci in 50 cases of non-familial young TNBC patients were found，4 of which were new loci；2 BRCA1 genemutation“hot spots”were found.③Compared with no BRCA1 mutation patients，BRCA1 mutation patients in 50 cases of non-familial young TNBC had higher rate of axillary lymph node metastasis（69.2%vs 35.1%），and later rate of TNM stage（77%vs37.8%），the differences were statistically significant（P＜0.05）. Conclusion The prevalence of BRCA1 mutations in patientswith non-familial young TNBC is higher inmulti-ethnic region of Xinjiang.212＋1G＞T and 2077G＞A may be genetic susceptible spot in non-familial young TNBC in Xinjiang region，and requiremore samples to confirm the results.Differences exist in clinical and pathological features between patients with BRCA1 genemutation and without of it.

BRCA1 genes；mutation；non-familial；young women；TNBC；clinical pathological features

R 737.9

A

1000－1492（2015）08－1168－05

2015－03－24接收

新疆维吾尔自治区自然科学基金（编号：2012211A031）

新疆医科大学附属肿瘤医院乳腺外科，乌鲁木齐 830011

刘晓丹，女，硕士研究生；

朱丽萍，女，主任医师，硕士生导师，责任作者，E-mail：zlp＿1005＠sina.com