氚照射对大鼠海马神经细胞黏附分子L1、NCAM表达的影响

王永生，姚晓波，蔡二朋，邱 俊，吴翠萍，王明明

氚照射对大鼠海马神经细胞黏附分子L1、NCAM表达的影响

王永生1，姚晓波2，蔡二朋3，邱 俊4，吴翠萍5，王明明1

目的探讨低剂量氚照射对大鼠海马神经细胞黏附分子L1、神经细胞黏附分子（NCAM）表达的影响。方法取24 h新生鼠脑海马细胞培养，培养第7天以3.7×102、3.7×103、3.7×104、3.7×105、3.7×106Bq／m l终浓度氚水照射细胞24 h，并设对照组（0 Bq／m l），活细胞工作站测定各处理组细胞的迁移距离；Western blot法、免疫细胞化学法检测各浓度氚水照射下神经细胞黏附分子L1及NCAM蛋白的表达情况。结果神经细胞迁移距离测定结果显示，与对照组相比，受照组细胞迁移距离明显缩短，且随着氚水浓度的不断增加而逐渐缩短（P＜0.05）；Western blot法、免疫细胞化学法检测显示受照组神经细胞黏附分子L1、NCAM蛋白表达含量均低于对照组，并随氚水浓度的升高表达量呈递减趋势（P＜0.05）。结论氚照射可致神经细胞黏附分子表达量减少进而可影响神经细胞的正常迁移。

大鼠；氚水；神经细胞黏附分子；神经细胞

脑中枢神经系统发育时期是哺乳动物胚胎发育的关键阶段，有研究［1，2］表明这个时期的孕鼠暴露于低浓度氚水辐射下其后代会出现特征性的大脑皮质畸形以及成年后行为表现异常。日本原爆幸存者辐射流行病调查［3］表明，胎龄8～15周受照幸存者神经元前体细胞增殖及增殖后的细胞从脑室迁移至大脑皮层的进程受到抑制，出现严重智力障碍。神经细胞的迁移过程涉及多种迁移相关因子参与，在这些迁移相关因子中神经细胞黏附分子L1、神经细胞黏附分子（neural cell adhesion molecule，NCAM）作为细胞迁移受体分子在神经细胞轴突生长、神经纤维成束、突触可塑性等方面发挥重要作用［4］，而低浓度氚水β辐射对神经细胞黏附分子表达的影响鲜有报道。为此，该研究从神经细胞黏附分子L1、NCAM受低浓度氚水辐射后的表达情况来探讨氚对脑发育期间神经细胞迁移的影响及机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 72只SPF级Sprague-Dawley（SD）大鼠，3月龄，购自常州卡文斯实验动物有限公司，大鼠均饲养于本实验室动物房。

1.1.2 试剂及仪器 氚水（中国原子能科学研究院）；DMEM／F12（1∶1）和B27（美国Gibco公司）；EGF、bFGF、胰蛋白酶、多聚赖氨酸（Poly-L-lysine）、阿糖胞苷（Ara-c）、苏木精（美国Sigma公司）；新生小牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司）；L1及NCAM抗体（英国Abcam公司）；二抗羊抗兔IgG（北京博奥生物有限责任公司）；β-actin抗体、HRP标记的羊抗小鼠IgG抗体、免疫组化试剂盒、DAB显色试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司）；水合氯醛（上海生物工程有限公司）；SW-CJ-1F型超净工作台（苏州净化设备有限公司）；BX-52型光学显微镜成像系统（日本佳能公司）；XS-212-201型光学显微镜（南京光电集团股份有限公司）；2123型CO2孵箱（美国Shellab公司）；Leica AF 6000活细胞工作站。

1.2 方法

1.2.1 海马神经细胞的原代培养 取24 h内的新生SD大鼠，性别不限，置于无菌操作室内，剥离出海马组织，并用预冷PBS液冲洗后备用。将所获得的新生大鼠海马组织放入无菌玻璃皿中，用眼科剪将其适量剪碎后加入0.125%胰蛋白酶消化20 min，加入同等体积胎牛血清终止消化。将消化后的液体装入一无菌小玻璃瓶放入低速离心机（1 000 r／min），离心5 min后在无菌操作台上弃去上清液，重新悬浮细胞，用血细胞计数板计数后分别接种在不含盖玻片和含盖玻片的6孔板中（6孔板已提前使用0.25%的多聚赖氨酸包被，灭菌双蒸水清洗3遍），种植密度5×106／皿，加入培养基4 ml，置于37℃、5%CO2饱和湿度的培养箱中。培养24 h后，将培养液半换液，培养第3天时，加入阿糖胞苷（终浓度为3μg／ml），24 h后去除。此后每2～3 d全换液1次。

1.2.2 细胞照射和培养 将培养的神经细胞经NF160免疫组化染色证实纯度达90%以上。培养7 d后加入氚水使各培养孔氚水终浓度分别为3.7× 102、3.7×103、3.7×104、3.7×105、3.7×106Bq／ml，照射24 h后进行实验，同时设细胞对照组。

1.3 活细胞工作站测定细胞迁移距离用Leica AF 6000活细胞工作站分别观察各处理组神经细胞的迁移情况，各处理组观察3个细胞，每个细胞观察时间为8 h，结果用LAS-AF-LITE 2.3.0软件进行分析。

1.4 Westernblot法检测L1、NCAM蛋白的表达

1.4.1 总蛋白提取及蛋白质定量 收集各实验组神经细胞，用预冷的PBS漂洗2～3次，按总蛋白提取试剂盒说明书步骤提取神经细胞内蛋白质。将总蛋白提取液取5μl样品加入995μl超纯水，于分光光度计下测量样本的各组蛋白质浓度。根据测出的样品蛋白浓度将其进行稀释，使各组样本的蛋白质终浓度一致。加入等体积蛋白上样缓冲液混合煮沸8 min，适量分装，－80℃保存备用。

1.4.2 Western blot步骤 配置10%分离胶和5%浓缩胶，取20μl总蛋白上样，经十二烷基硫酸钠－聚丙稀酰胺凝胶（SDS-PAGE）电泳后，转移到PVDF膜上，5%脱脂奶封闭1～2 h，TBST洗3次；加入一抗L1（1∶1 000）、NCAM（1∶1 000）；4℃封闭过夜，TBST洗3次；加二抗羊抗兔IgG（1∶5 000）室温孵育1 h，TBST洗3次；ECL工作液发光显影，定影晾干。

1.4.3 图像分析 分别对各组Western blot结果进行图像扫描，从各组随机抽取3张扫描图像，以Quantity-One生物医学图像分析系统进行目的条带半定量分析，各条带累积光密度（integral optical density，IOD）值／β-actin的IOD值，得到一相对强度（relative intensity，RI），通过各处理组RI值的比较可得出蛋白表达的变化规律。

1.5 免疫细胞化学染色法检测L1、NCAM蛋白的表达4%多聚甲醛固定细胞，室温15 min，0.5% TritonX-100孵育20 min，3%双氧水封闭内源性过氧化物酶，室温15 min，正常山羊血清处理，工作液室温孵育10～15 min，弃去上清液，一抗于37℃孵育2～3 h，生物素化二抗37℃孵育10～15 min，辣根过氧化物酶标记的链亲和素37℃孵育10～15min，DAB显色，苏木精复染细胞核，脱水，封片。常规设立阴性对照。各组每张盖玻片分别任意选取3个不同视野的细胞，于400倍镜下拍照，用Image Pro Plus软件进行阳性染色的平均光密度值分析。免疫组织化学染色以细胞质和（或）细胞膜出现黄棕色颗粒为阳性。

1.6 统计学处理采用SPSS 16.0统计软件进行分析，结果用±s表示，进行单因素方差分析（ANOVA），两两比较采用Dunnett-t检验。

2 结果

2.1 神经细胞迁移距离迁移距离测定结果显示，与对照组相比，各受照组神经细胞迁移距离普遍缩短（F＝47.553，P＜0.01），并且随着氚水浓度的逐渐升高呈现递减的趋势。见图1、表1。

表1 不同浓度氚水照射下神经细胞的迁移距离（n＝3

表1 不同浓度氚水照射下神经细胞的迁移距离（n＝3

与对照组比较：**P＜0.01

氚水浓度（Bq／m l）迁移距离（μm）对照组108.734±13.242 3.7×10278.383±7.707**3.7×10364.053±4.715**3.7×10452.533±2.315**3.7×10537.703±6.203**3.7×10621.302±4.978**

2.2 Westernblot检测结果与对照组相比，受照组细胞随着氚水浓度的增加，神经细胞表达的L1、NCAM蛋白含量逐渐降低，L1蛋白各组RI值比较，差异有统计学意义（F＝74.520，P＜0.01）；NCAM蛋白各组RI值比较，差异有统计学意义（F＝12.466，P＜0.01）。见图2。

2.3 免疫细胞化学染色法检测结果与对照组相比，受照组神经细胞平均光密度值普遍低于对照组，并随着氚水浓度的不断增加而逐渐降低，神经细胞L1、NCAM蛋白平均光密度值比较，差异有统计学意义（F＝53.968，P＜0.01；F＝19.736，P＜0.01）。见图3。

3 讨论

在中枢神经系统发育过程中，神经细胞迁移过程是复杂并被精细调控的，神经细胞在接受胞外信号后，将信号传递至胞内，最终到达胞内细胞骨架，通过微管、微丝及神经细胞黏附分子等共同作用完成整个迁移过程，到达大脑特定部位，构成复杂的神经网络体系，进而发挥正常的脑功能。在神经细胞迁移过程中，任何环节出现异常都会影响到神经细胞最终的正确定位。细胞迁移距离结果显示，神经细胞受氚水照射后，其迁移距离较对照组明显缩短，并且随着氚水浓度的不断增大迁移距离逐渐缩短。

神经细胞黏附分子L1、NCAM归属于免疫球蛋白超家族，是一种结构复杂的跨膜糖蛋白，通过亲同性和异同性结合介导细胞与细胞之间及细胞与细胞外基质之间的相互作用，能够多个分子共同作用于细胞外区域，在细胞质内也可以与细胞骨架蛋白actin可逆的结合［5］。目前的研究［6－8］表明，L1及NCAM充当整合素、生长因子的共同受体的同时也作为一种受体排斥的轴突导向分子。在促进神经细胞突触生长，神经细胞目标识别及神经细胞的正确迁移等过程中起着重要作用。

L1主要影响大脑皮层颗粒细胞的迁移过程［9］，在神经细胞发育和突触形成中都起着非常重要的作用，可通过同亲性机制或与其他的蛋白分子，如整合素、纤粘连蛋白受体和蛋白聚糖等异同性结合共同介导神经细胞的黏附。Ll还可通过锚蛋白与细胞骨架相连，参与细胞迁移运动过程及可在膜内通过它的寡聚甘露糖与NCAM结合，通过调节细胞黏附的作用来影响神经细胞正常的迁移过程。NCAM主要通过介导同源相邻细胞黏附来影响神经细胞的正常迁移过程，其主要通过三种机制［10］：①两个NCAM分子各自的IgⅢ结构域的相互作用；②两个NCAM分子的免疫球蛋白结构域反平行结合；③两个NCAM分子上的IgI和IgⅡ结构域的交互结合。这种同源性结合可介导细胞内的信号转导途经，过程可能与成纤维细胞生长因子（fibroblast growth factor，FGF）受体有关。NCAM可以和FGF受体上与NCAM同源的结构域相结合来调节FGF活性，进一步激活磷脂酶Cγ产生甘油二酯，通过电压依赖性钙通道诱导Ca2＋内流，促进神经细胞轴突生长，最终影响神经细胞的迁移过程。相关研究［11］表明电离辐射可导致L1、NCAM的表达含量降低进而影响大脑神经细胞的迁移过程，导致迁移障碍。先前的研究［12］也显示孕鼠脑受氚β射线辐射后，其神经细胞的L1、NCAM的含量普遍降低，妨碍了神经细胞的正常迁移，导致脑机能发生障碍。本研究结果表明，神经细胞受氚水照射后，L1、NCAM表达量较对照组明显减低，并且呈现出随氚水浓度不断增大而逐渐降低的趋势，这与细胞迁移距离的结果及先前的研究结果是相一致的，提示氚水可通过影响神经细胞黏附分子L1、NCAM的表达来影响发育期间脑神经细胞的正常迁移过程。

综上所述，氚水照射可下调仔鼠脑内神经细胞黏附分子L1、NCAM的表达，影响神经细胞黏附及神经细胞轴突生长等方面来妨碍神经细胞的正常迁移，通过研究氚水照射对发育中脑的影响可以深入了解氚辐射如何影响神经细胞迁移使神经细胞定位异常而最终导致脑机能障碍的机制，为日后预防氚的危害、治疗氚辐射损伤及制定安全卫生法规和标准、管理决策提供重要实验依据。

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［12］姚晓波，王永生，邱 俊，等.氚宫内照射对大鼠神经细胞分布及脑机能的影响［J］.安徽医科大学学报，2014，49（10）：1371－5.

Effects of irradiation from tritiated water on the expression of neural cell adhesion molecule L1 and NCAM of hippocam pus in rats

Wang Yongsheng1，Yao Xiaobo2，Cai Erpeng3，et al
（1Institute of Radiation Medicine，School of Clinical Medicine，Anhui Medical University，Hefei 230032；2Dept of Nuclear Medicine，Anhui Provincial Hospital，Hefei 230031；3Dept of Radiology，The Second People’s Hospital，Wuhu 241000）

Objective To explore the effects of low concentrations of tritium irradiation using tritiated water on the expression of neural cell adhesion molecule L1（L1）and neural cell adhesion molecule（NCAM）in vitro.MethodsHippocampal neuron cells from neonatal Sprague-Dawley（SD）rats（24 h）were primarily cultured in DMEM for 7 d，followed by exposure to tritiated water at concentrations of 3.7×102，3.7×103，3.7×104，3.7×105，3.7×106Bq／ml for24 h respectively，and cellswithout tritium irradiation served as control group（0 Bq／ml）.Live Cell Imaging System was performed to detect neuronalmigration capacity.Western blot and immunocytochemistry（ICC）were used tomeasure the expression levels of neural cell adhesion molecule L1 and NCAM.ResultsThe migration distance of irradiated neural cells was significantly shorter than that of the control group and declined gradually with increasing tritiated water（HTO）concentrations（P＜0.05）；Western blot and ICC showed that the expression of L1 and NCAM were both presented a dose-dependent decrease in hippocampalneuron cellswhen irradiated by tritium（P＜0.05）.ConclusionNeurons exposed to tritium irradiation are probably undergoing the decreased expression of neural cell adhesionmolecules，further leading to abnormal neuronalmigration.

rats；tritiated water；neural cell adhesion molecule；neural cell

R 811.5

A

1000－1492（2015）08－1102－05

2015－03－11接收

国家自然科学基金（编号：81273003）；安徽省自然科学基金（编号：1208085MH162）；安徽省教育厅自然科学基金（编号：KJ2011Z162）

1安徽医科大学临床医学院放射医学研究所，合肥 230032

2安徽省立医院核医学科，合肥 230032

3芜湖市第二人民医院影像科，芜湖 241000

4安徽省第二人民医院MRI室，合肥 230001

5肥东县人民医院呼吸科，合肥 230001

王永生，男，硕士研究生；

王明明，男，副教授，硕士生导师，责任作者，E-mail：wmgene＠163.com