H3N8亚型马流感病毒RT－LAMP检测方法的建立

姜 帆，张晓文，肖巧喆，郑小龙，于业锋，王 群＊

（1.山东出入境检验检疫局，山东青岛 266002；2.青岛检验检疫技术发展中心，山东青岛 266002；3.吉林大学动物医学学院，吉林长春 131000）

马流感（Equine influenza，EI）即马流行性感冒，是由正黏病毒科A型流感病毒属马H7N7亚型和H3N8亚型流感病毒引起的马属动物的一种急性传染性疾病，是严重危害马属动物的重要呼吸系统疾病之一［1］。马群一旦感染马流感病毒（Equine influenza virus，EIV），极易大范围迅速传播，常呈暴发性流行，感染率极高，是世界各国动物检疫部门重点防范的动物传染病之一［2－3］。我国也将其列为出入境检验检疫的马属动物必检疫病。近年来，随着动物的国际贸易，赛马的国际交流日益频繁和我国社会经济的不断发展，喜爱养马和赛马的人也越来越多，其传播风险也越来越高，由于该病扩散迅速、分布广泛，一旦暴发和流行造成的经济损失极为严重，已引起了广泛关注。

目前，检测EIV的常规方法主要有间接EIL SA、RT－PCR和荧光定量RT－PCR，这些方法操作

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 毒 株 马 流 感 病 毒 A／马／新 疆／1／07（H3N8）、马流感病毒 A／马／北京／1／74（H7N7）由哈尔滨兽医研究所动物流感中心提供；马动脉炎病毒（EAV）、马鼻肺炎病毒（EHV）由山东出入境检验检疫局动检疫实验室保存。

1.1.2 主要试剂 RT－LAMP试剂盒 RNA Amplification Kit、Fluorescent Detection Reagent为Loopamp荣研生物科技有限公司产品；RNA提取试剂盒 RNeasy Mini Kit、QIAgen One－step RTPCR Kit为QIAgen公司产品；AllPrep DNA／RNA Mini Kit、DNA Marker DL 2 000为宝生物工程（大连）有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 引物的设计与合成 根据GenBank中登陆的H3N8亚型马流感的HA基因序列（登录号：JQ955612.1、JN084397.1、 CY032945.1 和M73173.1等），通过MEGA 5.0软件进行基因的对比选取合适的保守区域，通过在线软件Primer Explorer V4 （http：／／primerexplorer.jp／e／）设 计LAMP引物，其中F3和B3是外引物，FIP和BIP为内引物，由宝生物工程（大连）有限公司合成。引物序列见表1。

表1 RT－LAMP引物序列Table 1 Primer sequence of RT－LAMP

1.2.2 H3N8亚型马流感病毒RNA的提取 按照RNeasy Mini Kit说明书提取H3N8亚型EIV的RNA，使用UV－1800紫外分光仪测定RNA的浓度，将病毒RNA保存于－80℃，备用。

1.2.3 RT－LAMP方法的优化 按照 RT－LAMP试剂盒说明书，在0.2mL离心管中依次加入病毒RNA 5μL（≥50ng），2×反应缓冲溶液12.5μL，Bst DNA聚合酶1μL，FD染料1μL，引物浓度比（内引物与外引物比例为1∶1、1∶2、1∶4、1∶8、1∶16），补充去离子水至25μL。改变反应的温度（60、61、62、63、64、65 ℃）和反应时间（30、45、60、75、90min）确定最佳反应条件。95℃2min终止反应，采用直接用肉眼观察和琼脂糖凝胶电泳两种方式来观察结果。

1.2.4 RT－LAMP灵敏度试验 H3N8亚型 EIV的RNA按101，102，……109进行梯度稀释，以稀释后的病毒RNA为模板，分别使用RT－PCR和RTLAMP方法进行检测。

按照 QIAgen One－step RT－PCR Kit的 说 明书，反应体系包括：模板5μL，上、下游引物F3和B3各2μL，QIAGEN One Step RT－PCR Enzyme Mix 0.5μL，10mmol／L each dNTP Mix 1μL，5×One Step RT－PCR buffer 5μL，补充去离子水至25μL。反应条件为：50℃30min，95℃15min，之后95℃30s，55℃30s，72℃30s进行30个循环；最后72℃10min。琼脂凝胶电泳观察结果。

按照优化的RT－LAMP反应体系及反应条件对不同稀释度的病毒RNA进行检测。采用目视和琼脂凝胶电泳两种方式观察结果。

1.2.5 RT－LAMP 特异性试验 按照 AllPrep DNA／RNA Mini Kit说明书，分别提取马流感病毒A／马／新疆／1／07 （H3N8）、马流感病毒 A／马／北京／1／74（H7N7）、EAV 、EHV 的 RNA／DNA，使用建立的RT－LAMP方法进行检测。采用琼脂糖凝胶电泳和目视两种方法观察结果。

2 结果

2.1 RT－LAMP方法的建立

通过优化，最佳引物浓度为5pmol／μL的外引物F3和B3各1μL，40pmol／μL内引物FIP和BIP各1μL。最佳反应条件为63℃75min；95℃2min，结果见图1。

图1 RT－LAMP方法的优化Fig.1 Optimization of RT－LAMP method

2.2 RT－LAMP检测H3N8亚型EIV灵敏度

运用优化的RT－LAMP检测方法与RT－PCR的方法对10倍梯度稀释的病毒RNA同时进行检测，结果显示，RT－LAMP方法的灵敏度比RT－PCR方法高10倍（图2）。

2.3 RT－LAMP检测特异性试验

图2 RT－LAMP与RT－PCR灵敏度的比较Fig.2 Comparison of sensitivity between RT－LAMP and RT－PCR

为验证所建立的RT－LAMP检测方法的特异性，分别以马流感病毒 A／马／新疆／1／07（H3N8）、马流感病毒 A／马／北 京／1／74 （H7N7）、EAV 、EHV的核酸为模板进行检测，结果显示仅H3N8亚型EIV可扩增出条带并见到绿色荧光，方法的特异性良好（图3）。

图3 RT－LAMP检测方法的特异性试验结果Fig.3 Specificity test for RT－LAMP methods

3 讨论

近年来，马流感在欧洲、北美州、南美州、大洋州、亚洲、非洲超过30个国家都有发生的报道，表现出全球性流行、流行范围广和发病频次高的趋势［6－8］。为我国普查与检疫，尤其对正在兴起的赛马业和发展提供了监测方法具有重要意义。根据病毒的抗原性不同，马流感病毒分为H3N8和H7N7两种亚型，H7N7亚型流感病毒导致的马流行性感冒病例在近40年来都未发现，已经不作为通常检疫的目标，马流感病毒H3N8亚型的检测在马流感病的诊断中占重要的地位。目前马流感病毒的检测方法有双抗体夹心ELISA、RT－PCR、间接ELISA抗体检测、抗原捕捉ELISA检测、荧光定量检测、基因芯片检测和RT－LAMP检测等。

LAMP技术已经应用到很多病原体的核酸检测中［9－13］，本研究针对马流感病毒 H3N8亚型基因的保守序列，设计特异性引物，优化反应条件，建立了马流感病毒的LAMP检测方法。试验结果表明，该方法操作简便，耗时短，设备要求低，检测结果是普通RT－PCR灵敏度的10倍，可以应用于进出口马流感病毒的检疫。在反应体系中添加荧光染料后，可通过肉眼观察判断有无扩增产物，无需电泳，既可避免电泳过程中其他杂质DNA的污染，又减少了实验室环境污染，尤其是在疫病防控的第一防线基层哨点部门或现场工作中，由于所需检测条件简单，LAMP技术更具备广泛的应用前景。我们对LAMP技术在H3N8EIV检测中的应用和评估也为今后该技术的推广利用积累了实验室经验，将会在疾病的早期诊断及预防控制方面发挥重要作用。

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