枯草芽孢杆菌B504菌株形态学及生理生化性状研究

李晓舟

[摘 要] 目前，生防细菌中应用较多的主要有：芽孢杆菌、假单胞杆菌、土壤放射杆菌等。其中，芽孢杆菌因其能够产生耐热、耐旱、抗紫外线和有机溶剂的内生孢子，是研究较多的一类生防细菌，是理想的生防菌筛选对象。枯草芽孢杆菌因其抑菌谱广且对多种植物病害具较好防效而得到广泛关注和研究。本实验主要是利用传统方法对枯草芽孢杆菌B504的细胞形态、结构及生理生化特性进行鉴定。

[关键词] 枯草芽孢杆菌 革兰氏染色

[中图分类号] S436 [文献标识码] A [文章编号] 1003-1650 （2015）10-0075-02

1 材料与方法

1.1 材料

枯草芽孢杆菌B504由辽宁省农业科学院植物保护研究所分离保存。枯草芽孢杆菌标准菌株Bacillus subtilis 168，对照菌株大肠杆菌 E. coli Top10由辽宁省农业科学院植物保护研究所保存。

1.2 菌株形态观察及生理生化鉴定方法

利用负染色，通过透射电镜观察菌体的形态、大小、鞭毛及其着生位置。以常规细菌学方法分析其形态和生理生化性状。

1.2.1 形态学特征

①革兰氏染色：接种针取适量菌苔，涂布于干净玻片上一滴蒸馏水中，风干固定；用结晶紫混合液（结晶紫 2 g，草酸铵 0.8 g，95%乙醇20mL，蒸馏水80mL）染色1min，用水冲洗后碘液（碘 1 g，碘化钾 2 g，蒸馏水300mL）作用1分钟，经过水洗、吸干； 95%乙醇或丙酮乙醇溶液脱色，流滴至无色；番红液染色3分钟，再次水洗、风干，镜检。

②鞭毛染色：接种环取已于斜面上培养18-24h的菌苔适量，置于干净玻片蒸馏水中，倾斜玻片，使菌液缓慢流淌，均匀分布于玻片上，然后平放于空气中自然干燥。涂片干燥后，先加甲液染色（丹宁酸 5g， FeCl31.5g ， 1.5%甲醛2mL，1%NaOH1mL， 蒸馏水 l00mL）10min，用蒸馏水冲洗，干燥。再加乙液（2%AgNO3）染色30～60s，加热，使其稍冒蒸气而染液不干，冷却后用蒸馏水冲洗，干燥、镜检。

③芽孢染色：孔雀绿染色法，按革兰氏染色涂片后，加孔雀绿染色液3-4滴，用木荚夹住载玻片，在火焰上加热，使有蒸汽产生，但勿使沸腾，如此反复染色10min。在染色中，依据蒸发情况随时添加染色液或水，使涂面上保持不干。用清水冲洗约半分钟，至无多余染色液流下为止。用2%番红染色3min，水洗，晾干。镜检。芽孢呈绿色，菌体和芽孢囊呈微红色。

④荚膜染色：将结晶紫自研钵中研磨后，加入95%酒精，继续研磨使之溶解，配成A液（结晶紫2.5g，95%酒精25mL）。将草酸铵溶解在蒸馏水中，配成B液（草酸铵1.0g，蒸馏水100mL） 。将A和B液混合既成。加2-3滴结晶紫染色液，放置3min，水洗，晾干。镜检，菌体周围透明部分为荚膜。

⑤菌落形态：用划线法将菌种接在平板培养基上，适温培养66h，出现单菌落开始观察，观察内容包括形状和大小、边缘、表面、隆起形状、透明度、菌落和培养基的颜色等。

1.3 生理生化特征

①芽孢厌氧性测定：将菌种用接种环穿刺接种在RA培养基（酪素水解物20g，NaCl5g，巯基醋酸钠2g，甲基次硫酸钠1g，琼脂15g，蒸馏水1000mL），30℃培养，3d和7d分别观察，若表面生长者为好氧菌，沿线生长或下部生长者为兼性厌氧菌或厌氧菌。

②耐盐性和需盐性：将菌种接种在含3%、5%、7%、10%的肉汁胨液体培养基中，28℃培养，培养3d、7d目测生长情况（培养基要十分澄清）。

③1.3.3柠檬酸盐利用：将菌株接种在柠檬酸盐斜面培养基（氯化钠5g，水合硫酸镁0.2g，磷酸氢铵1g，水合磷酸氢钾1g，柠檬酸钠2g，0.04%酚红10mL，琼脂12g，蒸馏水1000mL）上，28℃培养3-7d，培养基变为桃红色者为阳性，否则为阴性。

④丙酸盐利用：将菌株接在丙酸盐培养基（丙酸钠2g，氯化钠5g，水合硫酸镁0.2g，磷酸氢铵 1g，水合磷酸氢钾1g，0.04%酚红10mL，琼脂12g，蒸馏水1000mL）上，28℃培養3～7d，培养基变为桃红色者为阳性，否则为阴性。

⑤1.3.5氧化酶：置滤纸一张于干净培养皿中，滴少许四甲基对苯二胺的1%水溶液至滤纸湿润。用接种环取18～24h的菌苔，涂抹在湿润的滤纸上，在10s内涂抹的菌苔现蓝色者为阳性，60s以上现蓝色者不计，按阴性处理。

⑥接触酶：将培养24h的斜面菌种，用接种环取少许，涂抹于滴有3%过氧化氢的玻片上，观察有无气泡产生：有，阳性；无，阴性。

⑦甲基红（M.R）：在试管培养液（蛋白胨5g，葡萄糖5g，氯化钠5g，蒸馏水1000mL，pH7.0）中接种菌种，置适温培养48h。滴入甲基红试剂（甲基红0.1g，95%乙醇300mL，蒸馏水200mL）观察：红色，阳性；黄色，阴性。

⑧ V-P测定：接种菌种至试管培养液（蛋白胨5g，葡萄糖5g，氯化钠5g，蒸馏水1000mL，pH7.0）中，培养24h。 取培养液和40%氢氧化钠溶液等量混合。加入适量肌酸，静置10min，观察：培养液红色，阳性（偶尔出现延长静置时间，培养液才出现红色）。

⑨淀粉水解：将菌种接种在淀粉琼脂培养基（在肉汁胨中加0.2%可溶性淀粉）上培养2-5d，形成明显菌落后，在其上滴加碘液（碘1 g， 碘化钾2 g， 蒸馏水300mL），观察菌落周围有无透明圈：有，淀粉水解阳性；仍呈蓝黑色，阴性。

⑩菌株对糖类物质的利用：参照任新正（1994）的方法。

2 结果与分析

2.1 B504菌株的形态学特征

经透射电镜观察，菌株B504菌体呈杆状，细胞大小（0.93～1.4）μm×（3.3～3.9）μm，周生鞭毛（图3-1-A）。革兰氏染色呈阳性（图3-1-B、C），芽孢非圆形，不膨大（图3-1-D），无伴孢晶体，有荚膜（图3-1-E）。LB平板培养基上菌落近似圆形，边缘整齐，呈乳脂色，不透明，前期表面光滑（图3-1-F），后期表面褶皱明显（图3-1-G）。

图3-1 菌株B504的菌体形态和菌落形态

2.2 菌株B504生理生化特征

菌株B504的生理生化特征（表3-1）与标准菌株Bacillus subtilis 168对比，各项指标的阴性、阳性反应结果相同，部分生理生化反应特征图（图3-2）。

表3-1 菌株B504的生理生化特征

注：+ 为阳性反应；- 为阴性反应

图3-2 菌株B504部分生理生化性状

A：甲基红；B：V-P测定；C：柠檬酸盐利用；D：淀粉水解

结论

通过电镜观察，明确观察到了其菌体形态、大小和鞭毛着生状态及其在LB平板培养基上的菌落形态。结合B504菌株的硝酸盐还原、葡萄糖产酸等生理生化特征，将B504菌株初步鉴定为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。