肉类食品中猪源性成分检测方法之探讨

王志忠 漆晓华

摘 要：文章介紹了几种主流猪源性成分的检测方法，同时对各种方法的基本原理、适用范围及优缺点进行了探讨。希望对相关工作提供参考。

关键词：猪源性；检测方法；扩增；SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳

食品安全问题是一个永恒的话题，而清真食品安全也成为各穆斯林民族的关注点，其中肉类食品中猪源性成分的检测已提到一个重要的地位上来。目前，在动物源性成分的检测方法中，最主要的是基于蛋白质和基因的两大类检测方法，利用DNA的分子生物学方法开发定性、定量检测食品、饲料中动物源性成分的方法和技术已逐渐成为该领域的研究主流，也成为多数国家检测方法标准中指定的检测方法[1]。包括传统扩增（PCR）法，国家标准[2]就采用该法检测饲料中的猪源性成分，而实时荧光定量扩增（PCR）法和双重荧光扩增法是在传统实时PCR法基础上发展而来的，具有快速、高灵敏等优点。同时，亦有采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）法进行检测的研究，几种方法各有优缺点。下面，文章对常用的传统PCR法、实时荧光定量扩增（PCR）法和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）法进行分析探讨，供食品检验人员借鉴。

1 传统PCR法

传统PCR法的基本原理，是对高温下将双链DNA变成单链的模板DNA的两条链的一段互补序列，在适宜温度下与两条互不相补的寡核苷酸片段（引物）发生退火，利用DNA聚合酶催化延伸，如此反复扩增。然后利用凝胶电泳染色检测，与已知阳性、已知阴性及空白组进行对照，如果检测结果为阳性，再进行内切酶酶切反应，并将反应结果再次进行对照。酶切反应亦为阳性，则判定含有猪源性成分。

传统PCR方法的灵敏性和特异性较高，目前是鉴别猪源性成分的主要选择。但在检测中局限性较大，由于假阳性率高，最终定性需要进行酶切反应造成检测时间较长，而通过条带亮度进行定量准确性相对较差，特别是在较大浓度它种动物肉存在下会明显影响其灵敏度，不适用于掺入猪源性成分的肉类食品的检测。

2 实时荧光定量扩增（PCR）法

实时荧光定量扩增法是美国Applied Bio systems公司基于传统PCR法于1996年所提出，原理是在PCR反应体系中加入荧光基团，其中包括荧光染色和荧光探针两种办法（目前以荧光探针技术为主，其核心是利用Taq酶的3'→5'外切核酸酶活性切断探针，产生荧光信号），利用每次扩增循环的荧光信号积累实时监测整个PCR进程，在整个PCR反应过程中，荧光定量PCR仪对反应体系中荧光信号的变化量进行连续检测，记录其增加到某一阈值时所对应的PCR循环次数即循环阈值（Cycle threshold，Ct值），最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法[3]。由于在PCR扩增时期，模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在有线性关系，所以可以成为定量的依据。简单地说，其扩增程序与传统PCR法基本一致，但采用了在扩增过程中添加荧光剂的手段，并在每次扩增循环后收集荧光做出扩增曲线，根据扩增曲线和Ct值判定其结果。

实时荧光定量扩增法的优点是，缩短了检测时间，克服了PCR固有的平台效应，从而可以较为准确进行定量，同时在较大浓度它种动物肉存在下不会明显影响其灵敏度。但荧光探针法存在只适合特定目标、本底较低的探针难以找到等问题，特别是检测成本昂贵，难以大范围应用。

3 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）法

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）法的原理是，在一定条件下提取的不同肉类肌浆蛋白会存在含量和种类差异，利用此差异，筛选出用离子强度为0M的纯水提取肉中的肌浆蛋白，经过SDS-PAGE电泳鉴别猪肉特有的条带，从而区分猪肉和其它肉类。同理，该方法亦可区分鉴别其它肉类。

Orhan等人于2011年[4]利用肌浆蛋白亚基数和分子质量存在差异区别了生活在不同流域的远东红点鲑鱼；Magdalena[5]、Hugo A[6]等也利用了肌浆蛋白的亚基条带和分子量的差异对牛、马、猪、羊等动物物种进行了区分。

该方法的优点是，基于肌浆蛋白的差异性鉴定动物源性成分，较基于DNA序列特异性的PCR法成本较低，对仪器和操作要求也比较低，但在灵敏度、准确度和检测限等方面不及PCR法，特别是无法对猪源性成分进行定量，应用受到限制。

4 结束语

从上文看出，PCR和实时PCR法是目前猪源性成分检测的主流方法，其定性准确，并可以对被检成分进行定量，但对仪器设备要求较高，扩增耗时较长，难以进行快速检测，同时检测成本较高，特别是实时PCR法的成本昂贵。SDS-PAGE法检测成本较低，且耗时较少，适用于现场快速检测方法的开发，但灵敏度和准确度方面需进一步提高。

最后，需要说明的是，以上方法鉴别猪源性成分仅限于含有生鲜肉的制品，对于加工煮熟的肉制品则难以鉴定，尚需研究更新更好的检测方法。

参考文献

[1]李家鹏，乔晓玲，等.食品和饲料中动物源性成分检测技术研究进展[J].食品科学，2011，32（9）：340-346.

[2]GB/T 21101-2007.动物源性饲料中猪源性成分定性检测方法[S].PCR方法.

[3]Heid CA，Stevens J，Livak K J，etal.Real time quantitative PCR [J].Genome Research，1996，6：986-994.

[4]Orhan Demir，Ali Günlü，Fahrettin Kücük，et al. Analysis of sarcoplasmic proteins in natural populations of mountain trout with SDS-PAGE[J].African Journal of Biotechnology，2011，10（55）：11758-11763.

[5]Magdalena Montowska，Edward Pospiech. Species identification of meat by electrophoretic methods[J].Acta Sci.Pol.，Technol.Aliment，2007，6（1）：5-16.

[6]Hugo A，Caldironi，Nicolas G. Quantitative determination of low-salt soluble protein patterns of bovine muscles cooked at different temperatures，by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis[J].Jourmal of Food Science，1980（45）：901-904.