Fusarium mangiferae侵染对凯特杧内源激素含量的影响

柳凤　欧雄常　詹儒林　韦继光　常金梅

摘 要 为探讨杧果感染畸形病过程中顶芽内源激素含量的变化规律，以凯特杧为试验材料，测定了接种病菌（Fusarium mangiferae）后顶芽内生长素（IAA）、赤霉素（GA3）和脱落酸（ABA）含量的变化情况。结果表明：接种病菌后，杧果顶芽内赤霉素和生长素含量急速上升，且在整个试验阶段明显高于健康处理，脱落酸含量在试验后期不断升高；分析发现，F. mangiferae侵染能够显著影响杧果顶芽内源激素的含量，改变IAA/ABA和GA3/ABA的平衡，致使杧果的生长发育受到影响，进而引发畸形病的产生。

关键词 杧果；畸形病；Fusarium mangiferae；内源激素

中图分类号 S667.7 文献标识码 A

Abstract In order to study the effect of pathogens causing malformation on the endogenous hormone contents in Mangifera indica Keitt， we detected the changes of IAA， GA3 and ABA contents in buds affected by Fusarium mangiferae. The results showed that the contents of endogenous IAA and GA3 rose rapidly and were significantly higher than the control at at whole period after inoculation； ABA content rose at the late period after inoculation. The pathogens could affect the contents of IAA， GA3 and ABA in mango significantly and disturbed the balance of IAA/ABA and GA3/ABA， which affected the growth and development of mango， related to the mango malformation disease causing.

Key words Mangifera indica； Mango malformation； Fusarium mangiferae； Endogenous hormone

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2015.07.009

病原菌的入侵会强烈干扰植物体的正常代谢，内源激素作为植物体内重要的微量信号分子，必不可少的参与此过程，内源激素作为抗性因子，启动或抑制与抗病相关蛋白的基因表达，起到诱导或阻遏抗病性的产生，最终表现出感病或抗病[1-3]。脱落酸（ABA）、赤霉素（GA3）和生长素（IAA）是调节植物细胞生长代谢的重要内源激素，在植物生长发育中充当着重要而又复杂的角色，其含量及变化规律决定着细胞与组织的生长状况[4]。正常生长情况下，这些内源激素之间处于某种动态平衡状态，调节植物的生长发育[5]。病原物的入侵打破了植物体内各种内源激素之间原有的平衡状态，改变了各种内源激素之间的比值，从而使植株生长量减小，生长势弱，很快发生病变，甚至衰亡[6-7]。杧果畸形病是一种危害杧果正常生长的世界性病害，植株感病后嫩叶变细而脆，嫩芽、花序簇生，最后干枯，因此杧果染病后几乎不座果。国内该病主要分布在云南、四川海拔较高的杧果晚熟地区[8-10]。有研究报道患病组织的形成与杧果内源激素的失调有着十分密切的关系，但关于病原菌接种后杧果内内源激素含量的变化情况目前还无人测定[11]。本研究以中国杧果晚熟地区主栽品种‘凯特杧为材料，通过比较人工接种F. mangiferae后，健康与接种杧果内内源激素含量的差别，旨在阐明F. mangiferae侵染对杧果内源激素含量变化的影响，丰富杧果畸形病病原菌的致病机理研究。

1 材料与方法

1.1 材料

试验设病原菌接种处理和健康（对照）两组。供试MG06菌株为杧果畸形病病原菌F. mangiferae。以健康的一年生凯特杧实生苗为材料，采用组织块接种法接种。将病菌在PDA培养基上培养7 d后，菌落边缘打孔，取直径0.8 cm的菌饼作为接种体。利用解剖刀在顶芽下1～2 cm处刺伤，将菌饼菌丝面贴于刺伤处，保湿培养。每间隔5 d接种1次，共接种5次作为平行试验。接种0、15、30、45、60、75、90和105 d后取样。每处理每次取15个芽，在液氮冷冻中磨成粉状进行混匀，分开包装后置于-80 ℃冰箱中保存。

1.2 方法

1.2.1 内源激素的提取与纯化 每次取1.0 g杧果顶芽粉状物加10 mL提取液（80%色谱级甲醇，内含1 mmol/L的BHT二叔丁基对甲苯酚），4 ℃过夜后离心，沉淀中加5 mL提取液抽提2 h，收集所有的上清液测定总体积，37 ℃减压蒸发甲醇，留水相，之后加0.2 g的PVPP吸附酚类及色素，震荡10 min后离心取上清液，往上清液中加入等体积石油醚脱色2次，留水相，冰乙酸调pH至2.5～2.9，用等体积乙酸乙酯萃取3次，合并酯相，减压蒸干，用2 mL甲醇溶解。过C-18柱固相萃取柱进行纯化，具体步骤是：80%甲醇（1 mL）平衡柱→上样→收集样品→移开样品后用100%甲醇（5 mL）洗柱→100%乙醚（5 mL）洗柱→100%甲醇（5 mL）洗柱→循环。将过柱后的样品转入5 mL塑料离心管中，真空浓缩干燥，加1.5 mL甲醇溶解，过0.45 μm有机系针头式过滤器过滤，1.5 mL棕色液相上机瓶收集滤液，备用。

1.2.2 标准溶液的配制 将IAA、GA3、和ABA 3种标准样用色谱级甲醇溶解，分别配置为100 mg/L标准溶液，再将上述3种溶液配置成混合标准溶液待用。

1.2.3 标准曲线的制备及回收率测定 将各种激素标样在1.2.4的色谱条件下分别进样，进样量分别为5、10、15、20、25、30和35 μL。记录保留时间，以此确定为标样的出峰时间。采用峰面积外标法定量测定，以浓度Y（mg/L）为纵坐标，峰面积X（mV/s）为横坐标，计算得到各激素的标准曲线和相关系数。准确称取一定质量的标样，按1.21样品处理方法处理，根据加入量和检出量计算回收率，3次平行试验验证。

1.2.4 色谱条件 色谱仪为岛津（Shimadzu）高效液相色谱仪，包括LC-10ATvp高压泵，SPD-10Avp检测器，CTO-10ASvp柱温箱，C-R8A积分仪；色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18（4.6×250 mm，5 μm）；流动相：乙腈-甲醇-0.6%乙酸（50 ∶ 500 ∶ 450）；流速1 mL/min；柱温35 ℃；检测波长：254 nm；进样量10 μL。

1.3 试验数据的统计分析

数据的处理和分析均采用Microsoft Excel2003 软件及SPSS10.0 for Windows统计软件进行统计分析和Duncans（邓肯氏）多重差异比较，p<0.05为差异具有显著性。

2 结果与分析

2.1 标准曲线的制备及回收率测定

在选定的色谱条件下测得的赤霉素（GA3）保留时间为（3.361±0.050）s，线性回归方程为y=58.921x-19 489（R2=0.996 0），回收率为80.4%；生长素（IAA）保留时间为（5.155±0.061）s，线性回归方程为y=852.14x-31 248（R2=0.998 8）回收率为81.3%；脱落酸（ABA）保留时间为（7.374±0.049）s，线性回归方程为y=498.2x-38 003（R2=0.999 2）回收率为87.3%。

2.2 生长素（IAA）含量变化规律测定

杧果健康对照组与F. mangiferae接种处理组顶芽内IAA含量的变化趋势相同（图1），均表现出逐渐上升的趋势，但F. mangiferae接种组顶芽内生长素含量上升趋势明显高于对照组，且这种差异随着时间的延长逐渐加大。处理组顶芽内的生长素在接种病原菌15 d后即显著高于健康对照组，接种病原菌60～90 d内含量达到最高，约为1 700 ng/g FW，是对照组（约为700 ng/g FW）的2.5倍左右，接种病原菌105 d时，內源生长素含量虽略下降，但是仍显著高于健康对照组。

2.3 赤霉素（GA3）含量变化规律测定

从图2中可以看出，杧果受F. mangiferae感染后，其顶芽內源赤霉素GA3含量呈现出先上升后下降的趋势，接种病原菌45 d达到最大值，约为415.65 ng/g FW，是空白对照组（86.4 ng/g FW）的4.8倍，45 d后其含量略下降，但仍显著高于健康对照组。

2.4 脱落酸（ABA）含量变化规律测定

杧果顶芽內源脱落酸的含量在F. mangiferae侵染后变化趋势与生长素和赤霉素有所不同，接种病原菌60 d内无显著变化，随之迅速提高，接种病原菌105 d达到最大，为3 214.4 ng/g FW，是接种初期和对照组的2.6倍左右（图3）。

2.5 病原菌侵染后杧果内源激素比值的变化

植物激素间的生理效应既相互促进又相互拮抗，任何一类植物激素可影响到生长发育的多个过程，同样，植物生长发育是多种激素相互作用的结果。IAA和GA3能促进植物生长，延缓衰老，而ABA则促进植物衰老，其比值通常用来表示植物内源激素对生长的作用是促进还是抑制。从表1可以看出，在整个试验阶段，健康杧果顶芽内IAA/ABA和GA3/ABA基本呈现上升趋势，而处理组IAA/ABA和GA3/ABA出现先上升后下降的趋势，且前期上升幅度远大于健康对照组，后期又低于对照处理。由此推断，F. mangiferae侵染能够改变杧果顶芽内IAA/ABA和GA3/ABA的平衡，致使杧果的生长发育受到影响，进而引发畸形病的产生。

3 讨论与结论

脱落酸、赤霉素和生长素是调节植物细胞生长代谢的重要内源激素，在植物生长发育中充当着重要而又复杂的角色，其含量及变化决定着细胞与组织的生长状况。在植物体正常生长情况下，内源激素处于某种动态平衡状态，调节植物的生长发育。当病原物入侵植物体后，内源激素原有的动态平衡被打破，从而使植株生长发育受到影响，进而产生病害。高增贵等[12]采用酶联免疫吸附测定法，测定玉米苗期接种丝黑穗病菌后植株体内生长素、赤霉素、玉米素核苷和脱落酸4种内源激素的含量变化，从寄主与病菌互作过程中植物内源激素的变化研究玉米对丝黑穗病的抗性机制。研究结果表明，玉米丝黑穗病菌侵染玉米植株后，植株体内单一激素ABA含量提高；IAA、GA3和ZR的含量降低；IAA/ABA、ZR/ABA、GA3/ABA及（IAA+GA3+ZR）/ABA的比值均明显低于对照。赵锦等[13]用高效液相色谱法分别对健株、感病枣树内源激素的含量进行了测定，结果表明植原体侵染枣树植株后致使其内源激素失衡，主要是细胞分裂素含量的增加，最终导致了枣疯病症状表现。

将病原菌回接到杧果嫩梢上结果显示，45 d之后接种顶芽处形成大量凸起小芽包，75 d后凸起的芽包大量萌发，后期150 d萌发大量新芽，约是空白对照的7～9倍，且新叶细小生长缓慢，与对照相比节间偏短，与典型的枝叶畸形相同。本研究结果表明，F.mangiferae侵染后杧果顶芽内IAA、GA3和ABA的含量均有不同程度的提高，但提高幅度和病害的发展程度存在一定的相关性。病害发生初期，IAA和GA3含量迅速提高，刺激了杧果顶芽的迅速生长，形成大量新芽，然后由于顶芽的过度生长，植株营养状况的供给不足，因此形成的芽簇生叶片变细变脆。病害发生后期，ABA的含量迅速上升，顶芽长势病变，是组织衰老死亡的征兆。从内源激素比例中也可以看出，在供试试验阶段，健康对照组内IAA/ABA、GA3/ABA的比例呈逐渐上升的趋势，但是总体上升幅度不大。而接种处理组中，接种病原菌45 d时，GA3/ABA的比值高达0.320，约是健康处理组的5倍左右，接种病原菌60 d时，IAA/ABA的比值为1.428，健康处理组仅为0.572，GA3/ABA和IAA/ABA比值的增高促进了杧果顶芽的徒长。当接种病原菌105 d，接种病原菌的杧果顶芽内GA3/ABA和IAA/ABA比值均比健康处理组低，显示了杧果组织开始处于衰老和死亡的状态，然而杧果顶芽内的内源激素这种变化究竟是由病原菌侵染直接造成的，还是病原菌诱导了细胞损伤或影响了杧果顶芽同化作用后所造成的，还有待深入研究。

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