2，3－二氨基萘衍生化－气相色谱－质谱法测定血浆中的亚硝酸盐含量＊

刘国杰， 申小爱， 刘俊亭

（1.中国医科大学 公共基础学院 化学教研室，辽宁 沈阳110122；2.中国医科大学 法医学院，辽宁 沈阳110122）

近年来，临床医学对体内亚硝酸盐的研究日趋活跃.研究证实NO2－能和人、动物体中的二级胺或三级胺结合转化成强致癌物质亚硝胺，从而诱发癌变［1，2］.此外，最新的研究证实，NO2－在一些动物疾病模型中具有细胞保护作用，它能够抑制缺血和再灌注带来的心肌损伤［3，4］，减少梗塞面积，恢复心室功能［5］等，在预防和治疗心血管疾病中具有重大意义.在临床医学亚硝酸盐的研究中，体液内NO2－含量的测定贯穿于实验的始终，成为影响研究进展的关键所在.GC－MS法具有灵敏度高、分析速度快和鉴别能力强等特点，在生物样品分析中占有重要地位.但由于NO2－是水溶性无机阴离子，必须经过衍生化转换成极性小、挥发性强的物质，再进行GC－MS检测.文献方法中NO2－的衍生化试剂有苯、三甲氧基苯、甲苯［7，8］、PFB－Br［9～15］，这些方法普遍具有操作复杂、耗时长及易受干扰等特点，因此，研究一种快速准确地测定生物样品中亚硝酸盐含量的方法，在临床医学研究中具有实际应用价值.

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

亚硝酸盐血浆标准溶液，普罗地芬（SKF525A）内标溶液，2，3－二氨基萘溶液，甲醇，丙酮，异丙醇，乙酸乙酯，磷酸二氢钠，磷酸氢钠，碳酸铵.

Shimadzu GC－MS－QP2010，Rtx－5（10m×0.18mm×0.2μm），pH 测定仪，旋涡混合器，精密电子天平，TDZ4－WS台式离心机.

1.2 分析方法

取0.5mL血浆于试管中，加入pH＝3的磷酸缓冲溶液1mL，10μL 2，3－DAN溶液，60℃水浴中加热10min，冷却后，加入内标；加入碳酸铵调pH至8.5，2mL乙酸乙酯萃取，震荡1min，离心；取上清液N2气下浓缩至近干，吸取1μL GC－MS分析.柱温程序：柱初始温度为60℃，保持1 min后以15℃／min升至270℃，保持8min；EI离子源，电子能量为70eV，进样口温度为250℃，接口温度为270℃，离子源温度为200℃，检测器温度为200℃.GC－MS法分析采用全扫描（Scan）和选择离子检测（SIM）两种方式.以标准溶液浓度为横坐标，SIM色谱图中NO2－衍生物m／z 141的峰面积和内标m／z86的峰面积之比为纵坐标，绘制标准曲线，进行定量分析.

2 结果与讨论

2.1 衍生化反应机理

衍生化反应中，2，3－DAN和NO2－发生重氮化反应，然后与另一个氨基分子内缩合成环，生成1H－萘并［2，3－d］［1，2，3］三唑［6］，机理见图1，产物可在 NIST谱库检索出.

2.2 衍生化反应条件优化

衍生化反应过程中，反应液温度和pH值是影响重氮化的重要因素.实验中分别探索了20℃、40℃、60℃和80℃下衍生化反应的情况.结果表明：随着温度的升高，衍生化反应效率升高；当温度大于60℃时，衍生化产物的响应值明显高于室温下的响应值.因此，本实验的衍生化温度选择60℃.实验中，分别加入pH＝2，2.5，3，4，5，6，7，8的磷酸盐缓冲溶液，进行2，3－DAN 衍生化.实验数据证实pH在2～3之间，衍生化产物逐渐增加；pH＝3时，衍生化产物达到最大值；pH＞3时，两种衍生化产物迅速减少.因此，反应介质选择pH＝3的缓冲溶液.由于该衍生化的反应速度尚未有文献报道，因此考察了反应时间对2，3－DAN衍生化反应的影响.实验结果显示：反应5min后衍生化产物量明显增加，10min后，产量增加的趋势减缓，因此，本实验的衍生化时间选择为10min.

2.3 血浆中NO2－经衍生化后的色谱图

血浆中NO2－经2，3－DAN衍生化后，NO2－衍生物的保留时间为11.15min；内标的保留时间为12.35min；剩余的2，3－DAN衍生化试剂的保留时间为9.32min.色谱图分离度好、峰形尖锐、灵敏度高.图2为总离子流色谱图，图3为选择离子流色谱图.扫描时间范围为0～20min.NO2－衍生化产物特征离子（m／z）为：114，141和169；内标物SKF525A特征离子（m／z）为：86和99.

2.4 标准曲线及检测限

本实验选用内标法制备标准曲线，以标准溶液浓度为横坐标，以选择离子色谱图中NO2－衍生物 m／z 141的峰面积和内标m／z86的峰面积之比为纵坐标，如图4.实验结果表明血浆标准溶液中亚硝酸根离子在0.05～20μg／mL浓度范围内线性关系良好.线性方程为y＝0.162 5 x＋0.006 4，相关系数R2＝0.998 5.检测限按照三倍信噪比计算，该方法测定血浆标准溶液中NO2－的检测限LOD为0.005μg／mL.

2.5 精密度和回收率的考察

取高（10μg／mL）、中（1μg／mL）、低（0.1μg／mL）3个浓度的血浆标准溶液进行分析，日内精密度（n＝4）为3.43%～4.61%，日间精密度（n＝5）为4.25%～5.89%，NO2－回收率为89.43%～115.6%.

2.6 NO2－衍生物的稳定性

在标准NO2－水溶液中，按照上述处理方法进行2，3－DAN衍生化，得到衍生化产物后置于4℃的冰箱中冷藏，分别于0、2、4、6、8、12、24h后测定 NO2－离子的浓度.2，3－DAN 衍生化产物RSD%为2.11%.实验结果表明衍生物在4℃下具有良好的稳定性.

2.7 血浆样品分析

取非吸烟正常人静脉血血浆0.5mL，按照1.2分析方法平行测定3次，测得NO2－含量均值为0.354μg／mL.

3 结 论

2，3－DAN衍生化－GC－MS法无需相转移催化剂，可直接对血浆中的NO2－进行衍生化，该方法具有操作简便快捷、耗时更短、检测限更低、准确度和精密度高的优点，适于临床医学研究中的应用.

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