神经生长因子和蝮蛇抗栓酶对脑梗死大鼠海马神经元一氧化氮合酶阳性神经元的影响

张 晔 周郦楠

(辽宁卫生职业技术学院，辽宁 沈阳 110101)

心脑血管疾病具有致残率高、死亡率高、发病率高的特点，好发于50岁以上的中老年人，已严重威胁到人类的身体健康。如今，在我国有2.7亿余人患有心脑血管疾病，患病人数还在继续上升，其中多发性脑梗死(MCI)占的比重最大。因此，对多发性脑梗死发病机制及治疗措施的研究在提高患者生活质量等方面发挥了重要作用。本文探讨神经生长因子(NGF)和蝮蛇抗栓酯(Svate-3)对MCI大鼠海马神经元一氧化氮合酶(nNOS)的影响。

1 材料与方法

1.1 试剂 注射用神经活素(神经生长因子，NGF)及精制蝮蛇抗栓酶(Svate-3)购于中外合资大连斯威特制药有限公司;还原型辅酶Ⅱ购于中国国药集团上海化学试剂有限公司;硝基四氮唑蓝及三羟甲基氨基甲烷购于中国上海前进试剂厂。

1.2 动物及分组 雄性Wistar大鼠(由沈阳医学院实验动物中心提供)60只。所有大鼠适应性饲养5 d后，随机分为正常对照组20只、模型组20只及治疗组20只。各组在第1天和第7天分别取材10只。

1.3 MCI模型制备 将麻醉(1%戊巴比妥钠，40 ml/kg)后的大鼠在颈部正中切开、剥离，充分暴露处左侧颈内动脉、颈外动脉及其分叉处;用动脉夹对颈总动脉及颈内动脉的远心端进行无损伤夹闭;用眼科直剪在颈外动脉上剪一小口，逆行插入套管针并固定，拔出针芯，开放颈内动脉处的动脉夹，注入肝素盐水0.2 ml(含肝素10 IU)以及微小栓子悬浊液0.5 ml(25 g/L);注射完毕后，结扎颈外动脉剪口处的近心端，开放颈总动脉处动脉夹，使栓子通过颈内动脉进入颅内。最后，逐层缝合进行观察〔1～3〕。

1.4 术后处理 术后模型组用1 ml·100 g－1·d－1生理盐水灌胃。治疗组肌肉注射 NGF 500 BU·ml－1·d－1;尾静脉注射Svate-3 0.025 U·200 g－1·d－1，连续 7 d。

1.5 神经功能评分 于第1天和第7天进行神经功能评分，参照Longa等〔4〕的神经功能缺损评分标准。

1.6 取材切片 将麻醉(1%戊巴比妥钠，40 ml/kg)后的大鼠开胸，经升主动脉对大鼠进行内固定灌注(用0.1 mol/L PBS配置的4%多聚甲醛固定液)，结束后，端头迅速取出脑组织，置入同种固定液中4 h，然后将脑组织切成薄块，并放置在20%蔗糖溶液中脱水，于4℃冰箱内保存，直至脑组织薄块下沉，取出作冠状位连续冰冻切片〔5〕，片厚20μm。

1.7 尼氏染色 冰冻切片自冰箱内取出，室温晾干，用0.1 mol/L PBS将切片漂洗3次(5 min/次)，然后将切片置于10 g/L的甲苯胺蓝溶液中(37℃，90 min)，取出后，用蒸馏水进行冲洗，再用0.1 mol/L PBS将切片漂洗3次(5 min/次)。常规脱水、透明、封片，置于光镜下观察。

1.8 NOS免疫组织化学染色 用0.1 mol/L PBS彻底漂洗切片;室温下，在0.2%TritonX-100 PBS溶液中预孵育10 min;37℃下，在孵育液(NADPH-d 10 mg，NBT 5 mg，Triton X-100 0.03 ml，用 pH=7.4的0.1 mol/L磷酸盐缓液溶液配置成100 ml)中反应2～3 h;用0.1 mol/L PBS终止反应，并漂洗3次(1 min/次)。常规脱水、透明、封片。利用显微图像分析仪，对大鼠海马CA1区单位面积内形态、结构完整的存活神经元数及nNOS阳性神经元数量进行测定。

1.9 统计学分析 应用SPSS17.0软件进行t检验。

2 结果

2.1 各组大鼠实验前后体重(g)变化 第1天，各组实验动物体重无差异。第7天，正常对照组与第1天比较体重略有下降但无显著差异(P＞0.05);模型组和治疗组体重下降明显(P＜0.01);治疗组与模型组比较体重有所增加(P＜0.05)。见表1。

表1 各组大鼠实验前后体重变化(x±s，n=10，g)

2.2 不同时间点各组大鼠神经功能评分测定 第1天，正常对照组无神经功能的改变;模型组(2.50±1.08)和治疗组(2.40±0.70)大鼠均产生不同程度的神经功能障碍(P＜0.01)，但模型组与治疗组比较无显著差异(P＞0.05)。第7天，治疗组(1.20±0.92)与模型组(2.30±0.95)相比较有差异(P＜0.05)。模型组第1天与第7天神经功能无明显差异，治疗组第1天与第7天比较有显著差异(P＜0.01)。

2.3 尼氏染色结果 第1天，正常对照组尼氏染色切片上，大鼠海马CA1区神经元数量较多，排列紧密并且形态完整、分布均匀，胞质内可见丰富的尼氏体，染色正常。第7天，模型组大鼠海马CA1区切片上，可见少量神经元存活，有散乱无规则状的细胞碎片。第1天，模型组与治疗组神经元数较正常对照组明显减少(P＜0.01)。第7天，治疗组与模型组比较神经元数量显著增多(P＜0.01)。治疗组与同组第1天比较神经元明显增多(P＜0.01)，与正常对照组比较无显著差异(P＞0.05)。见表2。

表2 各组大鼠海马CA1区单位面积内神经元数量(x±s，n=10)

2.4 NOS免疫组化结果 正常对照组NOS阳性反应物呈蓝色，主要集中在胞质和突起，胞核不着色。第1天，模型组大鼠海马CA1区切片上，阳性神经元呈圆形或卵圆形的胞体，着色较深，突起较少;治疗组大鼠海马CA1区切片上，阳性神经元数量较模型组少，胞体呈圆形，胞体着色较浅，突起不明显。第7天，模型组大鼠海马CA1区切片上，阳性神经元分布稀疏，神经元的胞体呈圆形，胞体着色较浅，突起少;治疗组大鼠海马CA1区切片上可见胞体着色较模型组深，胞体呈圆形或椭圆形，突起可见。第1天，模型组与治疗组nNOS阳性神经元数量较正常对照组明显增多(P＜0.01);治疗组与模型组比较nNOS阳性神经元数量减少(P＜0.01)。第7天，模型组与正常对照组比较nNOS阳性神经元数量减少(P＜0.01)，治疗组接近正常对照组nNOS阳性神经元数量(P＞0.05)。治疗组第7天与第1天比较nNOS阳性神经元数量减少(P＜0.01)。见表3。

表3 各组大鼠海马CA1区nNOS阳性神经元数量(x±s，n=10)

3 讨论

一氧化氮(NO)是一种重要血管活性物质，最早在血管内皮细胞中被发现，其有局部血流调节的作用〔6〕，作为一种重要信使分子，虽然NO的化学结构简单，但它却能以相对特异的方式参与脑的多种生理病理过程〔7〕。

NO参与中枢神经系统脑组织内的许多生理功能:它能够促进神经递质的释放;参与突触可塑性的形成;参与了视觉、疼痛及气味区分;调节了血脑屏障的通透性;参与到学习和记忆过程;还参与到长时程增强(LTP)和神经系统的可塑性变化〔8〕。Kato等〔9〕认为，NO 的局部释放能调节海马 CA1 区的LTP阈值，激活NMDA受体释放NO，抑制LTP。

一氧化氮合酶(NOS)可以将精氨酸中的氮原子，在氧气(O2)及其他辅助因素参与下合成NO。因此，多数实验同过对NOS的研究来实现对NO作用的研究〔10〕。研究表明，NO参与了缺血性脑损伤的病理生理过程〔11〕。在此过程中，NO既有神经毒性又发挥了神经保护作用〔12〕。NO的神经保护作用表现在:①扩张血管，促进微循环，增加脑部血流量;②通过抑制血小板和白细胞的聚集，从而对血管内膜起到了保护;③抑制了由肾上腺素等物质产生的血管收缩，从而可以减轻缺血性脑损伤〔13〕。NO的神经毒性作用表现在:①大量羟自由基和二氧化氮自由基引起细胞蛋白质、核酸及脂肪膜损伤，导致细胞膜发生脂质过氧化作用，从而引起神经元死亡〔14〕;②神经毒性的产生是NO通过形成NO-铁复合物、巯基蛋白的氧化，形成超氧阴离子等方式实现的〔13〕。③神经元的迟发性死亡是由NO产生的ONOO-使线粒体内的锰超氧化物歧化酶失活，从而导致线粒体内O2

-增多引发的。脑缺血早期，内皮型一氧化氮合酶(eNOS)和nNOS表达水平都有所升高，其中eNOS产生的大量NO对脑有神经保护作用，但扩张脑血管的时间非常短暂，2 h后eNOS表达水平下降，对脑不再有保护作用;虽然nNOS比eNOS产生的NO少，但此种NO对脑有神经毒性作用。随着缺血时间的逐渐延长，NO主要来源于nNOS。本实验提示NGF和Svate-3对多发性脑梗死具有很好的治疗效果。

1 周郦楠，张 晔，张 晖.CGRP对多梗死大鼠海马CA4区NPY细胞影响的研究〔J〕．中国实用医药，2010;5(18):13-4.

2 李冬梅，王 戈.多发性脑梗塞动物模型的研究及分析〔J〕．内蒙古中医药，2014;29(3):57-8.

3 张 晔，张 艳，周郦楠.多发性脑梗死大鼠乳头体一氧化氮合酶改变〔J〕．中国实用医药，2012;7(6):37-8.

4 Longa EZ，Weinstein PR，Carlson S，et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats〔J〕．Stroke，1989;10(1):84-91.

5 包新民，舒思云.大鼠脑立体定位图谱〔M〕．北京:人民卫生出版社，1991:38-57.

6 王志浩，张岫美.一氧化氮与缺血性脑血管疾病〔J〕．国际病理科学与临床杂志，2005;25(5):466-70.

7 陈 琳，高 署，胡成穆，等.一氧化氮及一氧化氮合酶在脑缺血损伤中的作用〔J〕．安徽医药，2004;8(1):3-6.

8 包新民，舒斯云，曾建新.大鼠全脑缺血后纹状体边缘区内一氧化氮合酶、神经肽Y表达的变化〔J〕．第一军医大学学报，2001;21(9):644-7.

9 Kato K，Zorumski CF.Nitric oxide inhibitors facilitate the induction of hippocampal long-term potentiation by modulating NMDA responses〔J〕．JNeurophysiol，1993;70(3):1260-3.

10 Faraci FM，Brian JE.Nitric oxide and the cerebral circulation〔J〕．Stroke，1994;25(3):692-703.

11 Nishimura M，Izumiya Y，Higuchi A，et al．Adiponectin prevents cerebral ischemic injury through endothelia nitric oxide synthase dependent mechanisms〔J〕．Circulation，2008;117(2):84-91.

12 Adams JA，Wu D，Bassuk J，et al．Nitric oxide synthase isoform inhibition before whole body is chemia reperfusion in pigs:vital or protective〔J〕?Resrscitation，2007;74(3):516-25.

13 陈俊抛，郑文权，田时雨，等.大鼠脑缺血时脑组织中NOS1阳性神经元变化的连续观察〔J〕．临床神经病学杂志，1998;11(6):323-5.

14 商秀丽，赵久晗，薛一雪.脑缺血再灌注大鼠模型eNOS和nNOS的变化〔J〕．中国组织化学与细胞化学杂志，2010;19(1):49-52.