伏寒颗粒对先天伏寒小鼠模型免疫相关因子的影响

郭家娟 张 爽 李亦男 黄永生

(长春中医药大学附属医院，吉林 长春 130021)

“先天伏寒”理论是黄永生教授基于多年临床实践，结合前人伏邪理论，创新性提出的中医病因学说。经过多年临床实践，已经基本完备了先天伏寒证候的诊疗规范，组方伏寒颗粒应用于临床，取得了满意的疗效。为深入研究先天伏寒证候，并且使先天伏寒证候及伏寒颗粒的研究更客观化，本实验以建立先天伏寒动物模型为基础，观察伏寒颗粒对先天伏寒动物模型免疫相关因子的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物 Wistar大鼠，体重(23±2)g，由吉林大学动物实验中心提供，合格证号:SCXK-(J)2011-0003。

1.2 实验药物 氢化泼尼松注射液(天津药业焦作有限公司，生产批号:13031011);伏寒颗粒(长春中医药大学附属医院，批准文号:Z2013A004);金匮肾气丸(北京同仁堂科技发展股份有限公司制药厂，生产批号:13030925)。

1.3 试剂盒 大鼠超敏C反应蛋白(hs-CRP)、肿瘤坏死因子(TNF)-α、干扰素(IFN)-γ、白细胞介素(IL)-6、IL-4 酶联免疫分析ELISA试剂盒，均由上海邦奕商贸有限公司提供。

1.4 实验仪器 FAIO04电子分析天平(上海精密科学仪器有限公司);酶联免疫检测仪(南京华东电子集团医疗装备有限责任公司);京立LDZ5-2离心机(北京医用离心机厂);TH-212智能数字测温仪(北京鸿鸥成运科技有限公司)。

1.5 实验方法

1.5.1 肾阳虚模型的建立 4周龄Wistar大鼠48只，随机数字表法选取38只，雌雄各半为肾阳虚模型组;10只为正常对照组。肾阳虚模型组予氢化泼尼松腹腔注射，每只3.6 mg/100 g，连续14 d。同时附加寒冷因素:将大鼠分别置于2℃ ～4℃的冷水中游泳，每次5 min，1次/d，共14 d。造模完成后，观察精神状态、体重、皮毛光泽度、竖毛现象、反应灵敏度、是否喜欢拥挤在一起、大便湿度等一般状态确定造模是否成功。正常对照组常规喂养。

1.5.2 先天伏寒模型的建立 选取具有典型肾阳虚表现的肾阳虚模型组大鼠20只，另取正常的6周龄Wister大鼠10只，用摸球法随机平均分配为正常雄加阳虚雌、阳虚雄加阳虚雌、阳虚雄加正常雌各5对，分别同笼产子，得到的子代分别为正常雄加阳虚雌组、阳虚雄加阳虚雌组、阳虚雄加正常雌组，共同组成先天伏寒模型组。

1.5.3 灌胃给药 先天伏寒模型大鼠常规喂养至4周龄，通过一般状态观察，选取具有先天伏寒状态表现的大鼠，用查随机数字表法取45只，体重(23±3)g。用摸球法平均分成先天伏寒模型伏寒颗粒组，先天伏寒模型肾气丸组，先天伏寒模型空白对照组。伏寒颗粒组每日给予伏寒颗粒溶液(浓度10.4%)2.5 ml/100 g灌胃。肾气丸组每日予以金匮肾气丸溶液(浓度5.2%)2.5 ml/100 g灌胃，空白对照组给予等体积蒸馏水灌胃，共14 d。

1.5.4 观察指标 各组分别进行一般状态观察，口腔及前后爪温度测定，血清 IFN-γ、IL-4、hs-CRP、IL-6、TNF-α 含量测定。

1.6 统计学方法 采用SPSS13.0软件计量资料均以x±s表示，多组间两两均数比较采用单因素方差分析。

2 结果

2.1 各组一般状态表现 先天伏寒模型鼠喂养至4周龄，与同周龄肾阳虚模型鼠比较，体重稍有减轻，皮毛光泽度更差，竖毛现象更加明显，反应灵敏度更差，更喜欢拥挤在一起相互取暖，饮水量增加，大便湿度更高。

经14 d灌胃治疗，先天伏寒模型伏寒颗粒组与先天伏寒模型肾气丸组在一般状态表现方面较治疗前均有所改善，精神状态恢复，体重增加，皮毛光泽度改善，反应灵敏度增加，竖毛现象改善，饮水量减少，常喜欢拥挤在一起的现象减少，大便较前干燥。先天伏寒模型伏寒颗粒组较先天伏寒模型肾气丸组改善更明显。先天伏寒模型空白对照组未见明显变化。

2.2 口腔及前后爪温度测定 先天伏寒模型组口腔及前后爪温度与正常对照组对比有显著性差异(P＜0.01)。肾阳虚模型组与正常对照组小鼠比较，后爪(P＜0.01)及口腔和前爪温度差异均有统计学意义(P＜0.05)。先天伏寒模型组与肾阳虚模型组比较，口腔、前爪温度(P＜0.01)及后爪温度均有统计学意义(P＜0.05)。3组先天伏寒模型组口腔、前、后爪温度对比均无统计学意义(P＞0.05)。见表1。

经过2 w灌胃，与空白组对照对比，伏寒颗粒组和肾气丸组口腔及前后爪温度均有回升(P＜0.01，P＜0.05)。伏寒颗粒组口腔及前后爪温度回升较肾气丸组明显(P＜0.05)。见表2。

2.3 免疫指标检测 与同周龄肾阳虚模型组比较，先天伏寒模型组血清 hs-CRP、IL-6、IL-4、TNF-α 含量增高，IFN-γ 含量、Th1/Th2比值显著降低(P＜0.05，P＜0.01);正常雄加阳虚雌组，阳虚雄加正常雌组，阳虚雄加阳虚雌组之间相互比较差异不明显(P＞0.05)。见表3。

与空白对照组比较，伏寒颗粒组血清hs-CRP、TNF-α、IL-6、IL-4含量显著降低，IFN-γ的含量及Th1/Th2比值显著升高(P＜0.01);肾气丸组血清 hs-CRP、IL-4含量显著降低(P＜0.01)，IFN-γ的含量及Th1/Th2比值显著升高(P＜0.01)，血清TNF-α、IL-6含量降低(P＜0.05)。与肾气丸组相比，伏寒颗粒组血清 hs-CRP、TNF-α、IL-6、IL-4、IFN-γ 含量，Th1/Th2 比值有差异(P＜0.05)。伏寒颗粒与肾气丸对先天伏寒模型免疫相关因子均有影响，伏寒颗粒对先天伏寒模型免疫相关因子紊乱状态的改善优于肾气丸。见表4。

表1 先天伏寒小鼠与肾阳虚小鼠及正常小鼠口腔、前后爪温度比较(x±s，n=6，℃)

表2 伏寒颗粒与肾气丸对先天伏寒小鼠口腔及前后爪温度的影响(x±s，n=6，℃)

表3 先天伏寒小鼠与肾阳虚小鼠免疫因子比较(x±s，n=6)

表4 伏寒颗粒与肾气丸对先天伏寒小鼠免疫因子的影响(x±s，n=6)

3 讨论

先天伏寒动物模型是以中医理论为基础，通过模拟先天伏寒“男女媾精，阳气不足，寒伏于内”的病因理论来进行造模。先天伏寒于肾是其病因所在，随着病程的发展，可形成在下的阴寒格阳于上，阳不入阴，其症状表现除手足凉、以足凉为主的脾肾阳虚证等真寒之象外，还表现有口干、心烦等假热之象。本研究用肾阳虚大鼠同笼产子，通过观察新生鼠一般状态表现，发现先天伏寒模型大鼠显现出明显的“先天伏寒”症状，即体重减轻皮毛光泽度差，竖毛现象明显，反应灵敏度下降，喜欢拥挤在一起相互取暖，大便湿度高等寒象(真寒)，并且较肾阳虚模型鼠严重;同时表现有饮水量增加的热象(假热)。先天伏寒模型的这种寒热错杂表征与先天伏寒证候特点一致。

先天伏寒课题组前期的研究表明，先天伏寒证亚健康人群血清 IL-6、TNF-α水平升高，先天伏寒证候与阳虚证候存在着相似的炎症因子升高，但先天伏寒证的血清hs-CRP升高更明显〔1〕。

本实验研究结果表明，此先天伏寒模型造模方法得到的动物模型较符合先天伏寒证候本质，为进一步探讨理想的先天伏寒动物模型提供了理论依据和实践经验。先天伏寒证候存在免疫系统紊乱，除先天伏寒课题组前期实验已经证明的hs-CRP、TNF-α、IL-6 增高外，可能存在 Th 亚群紊乱，以 IFN-γ、Th1/Th2比值降低、IL-4增高为特点。本实验微观生物学指标可作为先天伏寒证候进一步研究的参考。

中医治疗的根本原则是“治病求本”，求本是任何疾病实施治疗时都应首先遵循的原则。黄永生教授在遵循先贤治病求本理论基础上，通过对多年临床经验的总结，认为先天伏寒证究其根本病性属阴，病因为先天伏寒于肾，病机特点为“气(阳)虚气滞、寒热错杂”，寒为阴邪，随着人体肾气的衰退，脾肾之阳受损，治疗上首要任务为温补脾肾之阳，同时补益中气。用仙茅，仙灵脾、巴戟天以温补脾肾之阳，用黄芪、白术补益中气、充健脾气。伏寒于肾，寒盛于下，使阳无宅，逼阳外走，浮跃于上，故在益气温阳的同时，还加用苦寒而降的知母、黄柏，引阳归阴，使真龙归于肾水，生化无穷。用辛温发散、醒脾开胃的清夏，畅达气机升降之路，使肺气宣降，阴火下行畅达无阻。现今社会纷繁复杂，人们多处在所愿不遂的心理状态之中，故疏肝理气法要贯彻治疗的始终，应用理气之品枳壳，合行滞止痛之品青皮以疏肝理气;最后辅以辛甘之品当归，补血活血的同时助黄芪以益气健脾;理气温中之品砂仁以疏泄气机，醒脾开胃。根据以上，黄永生教授立方伏寒颗粒，针对先天伏寒证进行治疗，临床收效明显〔2〕。

本实验研究表明，伏寒颗粒对先天伏寒证的疗效优于肾气丸，可有效改善先天伏寒模型免疫因子的紊乱状态，使血清免疫因子(hs-CRP、TNF-α、IL-6、IL-4、IFN-γ、Th1/Th2 比值)水平呈正向改变趋势。以方测证，说明本实验得到的先天伏寒大鼠模型比较符合先天伏寒证候特点，为进一步研究先天伏寒动物模型提供了理论及实践参考。

1 崔英子.从“先天伏寒”论治冠心病及其与神经内分泌免疫相关因子关系的研究〔D〕．长春:长春中医药大学硕士学位论文，2010:95-111.

2 崔英子，郭家娟，黄永生.从先天伏寒论治冠心病心绞痛126例临床观察〔J〕．中医杂志，2010;51(6):516-9.