表没食子儿茶素没食子酸酯对131I辐射损伤所致甲减大鼠模型抗氧化体系的保护作用

陈雪梅 周树云 范源 瞿博

表没食子儿茶素没食子酸酯对131I辐射损伤所致甲减大鼠模型抗氧化体系的保护作用

陈雪梅 周树云 范源 瞿博

目的 探讨不同剂量表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）对131I辐射损伤所致甲状腺功能减退症（甲减）大鼠抗氧化体系的保护作用。方法 3月龄健康SD大鼠52只，随机分成6组，即空白组、模型组、甲状腺片组、EGCG低剂量组（25mg·kg-1·d-1）、EGCG中剂量组（50mg·kg-1·d-1）、EGCG高剂量组（100 mg·kg-1·d-1）。除空白组外，其余5组给予131I灌胃2周以造甲减大鼠模型，造模成功后，空白组、模型组给予生理盐水，其他组给予相应的药物。4周后，利用生物化学方法测定大鼠血清中游离三碘甲状腺原氨酸（FT3）、游离甲状腺素（FT4）、TSH水平，同时测定超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、过氧化氢酶（CAT）的含量。结果与模型组相比，甲状腺片组、EGCG组大鼠血清FT3、FT4水平均有升高，甲状腺片组、EGCG高剂量组TSH水平明显降低，EGCG低剂量组、EGCG中剂量组差异无统计学意义；与模型组相比，甲状腺片组、EGCG组的SOD水平明显降低，GSH-Px水平明显升高；EGCG中、高剂量组CAT水平显著升高。结论 EGCG能减轻131I辐射对大鼠甲状腺组织的氧化损伤，可保护大鼠抗氧化体系。

碘放射性同位素；辐射损伤；甲状腺功能减退症；表没食子儿茶素没食子酸酯；抗氧化体系

131I是治疗甲状腺功能亢进症（甲亢）的重要方法之一，但131I在治疗甲亢的同时也对甲状腺本身有一定程度的损伤。近年来，临床上应用131I治疗甲亢越来越普遍，但甲状腺功能减退症（甲减）的发生率也越来越高。

目前，131I治疗甲亢的原理是根据甲状腺具有高选择性摄取131I的能力，利用131I衰变为131Xe时放出β射线，使甲状腺组织产生炎症、萎缩，直至功能丧失等变化而达到治疗目的。辐射损伤的主要原因为辐射产生自由基的原发反应与继发反应的综合结果，自由基的大量生成可导致机体的抗氧化体系失去平衡，最终引起细胞代谢障碍，对机体造成损伤[1-2]。Boelaert等[3]使用3种不同的固定剂量来治疗甲亢，发现大剂量治疗甲亢缓解率高，但一年后甲减的发生率亦明显高于小剂量治疗。Metso等[4]采用前瞻性队列研究随访观察2043例患者，结果发现131I治疗后大多数Graves病患者最终发展为甲减，Graves病在131I治疗后1、10、25年甲减的累积发生率分别为24%、59%、82%。

表没食子儿茶素没食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）是茶多酚中最有效的活性成分，属于儿茶素类。EGCG具有抗菌、抗病毒、抗氧化、抗动脉硬化、抗血栓形成、抗血管增生、抗炎以及抗肿瘤的作用。EGCG依靠其分子中的多个酚羟基作为供氢体，提供质子H与辐射产生的自由基结合，消除机体内过量的自由基，从而减少氧自由基的产生，并能夺取过氧化过程中产生的脂质过氧化自由基，打断自由基氧化链反应，有效清除体内自由基，避免大分子的损伤而起到辐射防护的作用[5]。机体的抗氧化系统由一系列抗氧化酶，如超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）、过氧化氢酶（catalase，CAT）等组成，它们对机体活性氧类（reactive oxygen species，ROS）的清除发挥着重要作用[6]。

本研究采用131I辐射造成甲减大鼠的动物模型，应用不同浓度的EGCG溶液灌胃并观察其对甲状腺功能低下大鼠已损伤的抗氧化体系的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物

清洁级雄性SD大鼠（购自四川简阳达硕动物科技有限公司）52只，体质量（220±20）g，合格证号为0003429，许可证号为scxk（川）2013-24，所有动物购回后适应性喂养1周，采用普通饲料、自来水喂养，无不良反应。

1.2 药物和试剂

1.3 实验仪器

酶标仪为芬兰Labsystems Multiskan MS产品，型号为352型；洗板机为芬兰Thermo Labsystems产品，型号为AC8。

1.4 药物配备

Na131I制备液：将7 ml Na131I溶液加0.9%生理盐水稀释至144 ml。

左甲状腺素钠制备液：将左甲状腺素钠片研碎，按药物质量∶动物体质量为18 μg∶1 kg的比例称取，用生理盐水配成混悬液。

EGCG溶液制备液：称取EGCG粉末加入生理盐水配置成不同浓度溶液，浓度分别为低剂量组（25 mg·kg-1·d-1）、中剂量组（50 mg·kg-1·d-1）、高剂量组（100 mg·kg-1·d-1）。

springer是Springer-Verlag的简称，德国Springer-Verlag(斯普林格)出版社是世界上最大的科技出版社之一，它有着170多年发展历史，以出版学术性出版物而闻名于世，它也是最早将纸本期刊做成电子版发行的出版商。旗下品牌有Springer、Nature Research、BiomedCentral、Palgrave Macmillan、Scientific American。出版过150多位诺贝尔奖获得者专著，其nature品牌在科技界拥有极高的声誉。

1.5 动物分组与造模

适应性喂养1周后，将52只大鼠随机分成6组：空白组（n=7）（本实验初选空白组9只，实验开始前2只出现死亡，故移除）、模型组（n=9）、甲状腺片组（n=9）、EGCG低剂量组（n=9）、EGCG中剂量组（n=9）、EGCG高剂量组（n=9）。造模组[包括模型组、甲状腺片组、EGCG组（低、中、高剂量）]大鼠均灌胃Na131I溶液1 ml/100 g体质量，空白组大鼠给予等体积生理盐水，每日1次连续2周后，由大鼠目眦取血1.5ml，离心（离心半径9cm，6500 r/min，离心5 min）分离血清后检测FT3、FT4、TSH水平，依据测定结果确定造模成功与否，与空白组相比，FT3、FT4水平下降，TSH水平上升则造模成功。

1.6 给药方法

确定造模成功后立即给药，连续给药4周，每3 d称重以调整给药量，各组给药量具体如下：空白组、模型组按0.1 ml/kg体质量的容积给予生理盐水；甲状腺片组给予左甲状腺素钠制备液（10 μg/kg体质量）；EGCG组（低、中、高剂量）分别给予EGCG制备液（生药）25、50、100mg·kg-1·d-1，每日灌胃1次。

1.7 生化检测

给药治疗4周后，将各组大鼠禁食不禁水12 h，由大鼠目眦取血1.5 ml，离心5 min（离心半径9 cm，6500 r/min），取血清，分别检测甲状腺功能，用放射免疫分析法检测血清FT3、FT4水平，用双抗夹心法检测TSH水平。

1.8 抗氧化能力检测

给药治疗4周后，将各组大鼠禁食不禁水12 h，由大鼠目眦取血1.5 ml，离心5 min（离心半径9 cm，6500 r/min），取血清，分别用化学发光法、比色测定法、钼酸铵显色法测定SOD、GSH-Px、CAT的含量。

1.9 统计学方法

2 结果

2.1 空白组与造模组大鼠甲状腺功能指标比较

与空白组相比，造模组大鼠饮食及饮水减少，体质量减少，随着病程的进展甲减大鼠体质量逐渐减少。由表1可见，造模2周后，造模组大鼠血清FT3、FT4水平比空白组显著降低，TSH水平明显升高，表明造模组大鼠均已出现131I辐射所致甲状腺功能低下的状态，证明造模成功。

表1 空白组与造模组大鼠甲状腺功能检测指标比较（±s）Table 1 Comparison of thyroid function indexes between normal and model rats（±s）

表1 空白组与造模组大鼠甲状腺功能检测指标比较（±s）Table 1 Comparison of thyroid function indexes between normal and model rats（±s）

注：表中，FT3：游离三碘甲状腺原氨酸；FT4：游离甲状腺素。

组别 只数 FT3（pmol/L） FT4（pmol/L） TSH（μIU/ml）空白组 7 18.46±1.50 48.52±2.44 13.17±0.76造模组 45 13.13±1.83 34.88±4.91 16.48±4.67 t值 7.326 11.593 -3.275 P值 <0.01 <0.01 <0.01

2.2 给药治疗4周后大鼠甲状腺功能状态

甲状腺片组大鼠体质量较模型组大鼠有所增加，饮食及饮水增加。由表2可见，与模型组相比，甲状腺片组、EGCG组（低、中、高剂量）大鼠血清FT3、FT4水平均有升高，FT3水平在EGCG低剂量组和高剂量组中随剂量增加呈上升趋势，较中剂量组明显；FT4水平随EGCG剂量增加呈递减趋势，剂量越高，升高的幅度有所下降；甲状腺片组、EGCG高剂量组TSH水平显著降低，差异有统计学意义，而EGCG低剂量组、中剂量组TSH水平无明显变化。

表2 治疗结束后各组大鼠的甲状腺功能状态（±s）Table 2 The thyroid function of rats in each group after treatment（±s）

表2 治疗结束后各组大鼠的甲状腺功能状态（±s）Table 2 The thyroid function of rats in each group after treatment（±s）

注：表中，EGCG：表没食子儿茶素没食子酸酯；FT3：游离三碘甲状腺原氨酸；FT4：游离甲状腺素。与空白组比较，ΔΔP＜0.01；与模型组比较，**P＜0.01。

组别 只数 FT3（pmol/L） FT4（pmol/L） TSH（μIU/ml）空白组 7 18.55±1.79 47.72±2.90 13.60±1.10模型组 9 12.06±1.09ΔΔ（t=9.004）17.88±0.76ΔΔ（t=-9.212）甲状腺片组28.78±4.41ΔΔ（t=9.801）13.05±0.90**（t=12.291）EGCG低剂量组9 14.10±0.52**（t=-5.067）34.63±3.65**（t=-3.064）9 13.09±2.54 41.37±3.48**（t=-6.719）17.82±1.06 EGCG中剂量组9 12.19±2.66 38.72±3.65**（t=-5.211）18.32±1.00 EGCG高剂量组9 14.33±0.52**（t=-5.639）32.43±1.84 16.21±0.49**（t=5.541）

2.3 EGCG对131I辐射损伤的甲状腺细胞内SOD、GSH-Px、CAT水平的影响

由表3可见，与模型组相比，甲状腺片组、EGCG组（低、中、高剂量）的SOD水平明显降低，其中，EGCG高剂量组变化最明显，低剂量组变化较中剂量组明显；甲状腺片组、EGCG组（低、中、高剂量）GSH-Px水平明显升高，其中，EGCG低剂量组和高剂量组较中剂量组变化明显；EGCG组（低、中、高剂量）中CAT水平随剂量升高呈递增趋势。

表3 EGCG对131I辐射损伤的甲状腺细胞内SOD、GSH-Px、CAT水平的影响（±s）Table 3 Effects of EGCG on SOD,GSH-Px and CAT levels in the thyroid cells injuried by131I radiation（±s）

表3 EGCG对131I辐射损伤的甲状腺细胞内SOD、GSH-Px、CAT水平的影响（±s）Table 3 Effects of EGCG on SOD,GSH-Px and CAT levels in the thyroid cells injuried by131I radiation（±s）

注：表中，EGCG：表没食子儿茶素没食子酸酯；SOD：超氧化物岐化酶；GSH-Px：谷胱甘肽过氧化物酶；CAT：过氧化氢酶；与空白组比较，ΔΔP＜0.01；与模型组比较，**P＜0.01，*P<0.05。

组别 只数 SOD（U/ml） GSH-Px（pmol/ml） CAT（U/L）空白组 7 54.83±3.52 40.59±2.19 3.53±0.16模型组 9 74.71±6.12ΔΔ（t=-8.159）2.86±0.24ΔΔ（t=6.275）甲状腺片组31.80±3.65ΔΔ（t=5.612）9 65.11±4.00**（t=3.939）44.93±2.76**（t=-8.606）2.91±0.21 EGCG低剂量组9 64.88±3.71**（t=4.119）39.84±2.61**（t=-5.375）2.61±0.25 EGCG中剂量组3.44±0.24**（t=-5.181）EGCG高剂量组9 67.07±4.69**（t=2.973）35.45±3.46*（t=-2.179）9 61.80±4.51**（t=5.091）43.42±3.44**（t=-6.945）3.75±0.27**（t=-7.390）

3 讨论

131I辐射损伤的主要原因是辐射产生自由基的原发反应与继发反应的综合结果，包括对造血系统的损伤、对DNA的损伤及对免疫系统的损伤等，自由基的大量生成可导致机体的抗氧化体系失去平衡，自由基可攻击生物膜磷脂中的多不饱和脂肪酸而引起脂质过氧化，最终引起细胞代谢障碍，对机体造成损伤[1-2]。由于化学类辐射防护剂使用的局限性和不良反应等原因，从天然产物中寻找具有辐射防护作用的成分具有很好的前景，目前已发现如多糖、生物碱、香豆素、黄酮类、皂苷类等化合物有一定的抗辐射损伤作用[7]。

131I发射的β射线对甲状腺组织产生的过多细胞因子和B淋巴细胞也会产生一定的抑制或破坏作用。β射线对靶分子的离子化作用导致ROS迅速爆发性生成并作用于生物大分子，造成多种靶细胞损伤，激活炎症细胞，使炎症因子表达增加，引起肺组织炎症反应。研究表明，炎症细胞如巨噬细胞、单核细胞、嗜中性粒细胞等激活后，细胞内的各种氧化酶表达水平升高，合成并释放大量ROS，以清除坏死的细胞，这些ROS又可协同炎症因子促使血小板衍生生长因子、成纤维细胞生长因子、转化生长因子等的表达过度增加，导致组织过度修复。局部产生的ROS还可在细胞间发挥第二信使的作用，通过激发趋化因子表达，增加炎症细胞黏附，引起炎症细胞因子的级联增加效应，加重组织炎症反应。

Sawant等[8]研究发现，甲减可引起肾脏组织氧化应激反应增强，SOD活性显著降低，GSH-Px活性明显增强，CAT活性无明显变化。Moulakakis等[9]研究表明，甲减时血清中CAT水平明显升高。本研究发现，甲减大鼠肾组织SOD活性明显下降，GSH-Px水平明显升高，与前述研究结果一致；CAT水平明显升高，与前述研究结果不一致。提示GSH-Px的代偿性升高不足以抵消SOD活性的下降，以致氧自由基不能被有效地清除，过氧化终产物SOD水平显著升高，说明甲减大鼠肾脏的氧化应激反应增强。

血清SOD活性和GSH-Px、CAT水平是反映机体氧化应激能力的重要指标。SOD对机体氧化/抗氧化平衡起着至关重要的作用，该酶能清除氧自由基，保护细胞免受损伤[10]。本研究结果显示，EGCG能明显升高模型大鼠血清GSH-Px水平，显著降低血清SOD活性，提示其在治疗放射性甲状腺损伤过程中充分发挥了抗氧化及提高抗氧化酶活性的作用。

8-羟基-2’脱氧鸟嘌呤核苷（8-hydroxy-2’-deoxyguanosine，8-OHdG）是活性氧自由基氧化损伤细胞核DNA或线粒体DNA后形成的产物，是DNA发生氧化损伤的生物标志物。Xu等[11]利用烟草特有亚硝胺4-（methylnitrosamino）-1-（3-pyridyl）-1-butanone（NNK）对小鼠肺部的致癌作用，通过对照试验，验证了EGCG具有抗肺癌的功效，并对实验组（NNK+EGCG）和对照组（NNK）小鼠肺部8-OHdG的含量进行了检测，发现实验组小鼠的8-OHdG含量明显低于对照组，即EGCG能够有效地抑制小鼠肺部细胞DNA中8-OHdG形成，从而得出了EGCG的抗氧化特性在抗肿瘤活性中发挥了一定作用。核因子相关因子2是在氧化应激应答中起核心调控作用的核转录因子，血红素加氧酶1、醌氧化还原酶1是受其调控的主要抗氧化酶。Sahin等[12]在用EGCG干预顺铂引起的肾损害的研究中发现，EGCG能显著减少机体过氧化物及脂质过氧化物产物，增强抗氧化酶活性，改善机体的抗氧化状态，证实EGCG可通过诱导激活核因子相关因子2和血红素加氧酶1，增加其调控的下游抗氧化酶的表达而发挥抗氧化应激作用。

本研究观察了不同剂量EGCG在131I辐射损伤所致甲减大鼠模型中的作用。研究结果表明，大鼠受辐射后甲状腺受到损伤，易发生甲减，EGCG可对抗131I辐射损伤大鼠的氧化应激效应，提高辐射损伤大鼠血清中的SOD活性，降低GSH-Px的水平，提高CAT的水平，与模型组相比差异有统计学意义。针对131I的辐射损伤，EGCG具有消除自由基、抗氧化作用，可通过提高被辐射动物体内的抗氧化酶活性、降低脂质过氧化反应水平，而减轻辐射所致的过氧化损伤。通过体内实验发现，EGCG可减轻131I辐射对甲状腺的过度损伤并可对甲减大鼠模型的抗氧化体系产生保护作用，为以后EGCG的临床应用提供了有力的实验依据，也显示其在临床核医学的防辐射领域中有较好的应用前景。

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Protection of antioxidant system of EGCG on the thyroid in rat model from131I radiation damage

Chen Xuemei*,Zhou Shuyun,Fan Yuan,Qu Bo.*Specialty of Pharmaceutical,Yunnan University of TCM,School of Pharmacy,Kunming 650500,China

Fan Yuan,Email：1647909799@qq.com；Qu Bo,Email：1061508680@qq.com

ObjectiveTo investigate the protection of different doses of epigallocatechin gallate（EGCG）on131I radiation-induced thyroid dysfunction in rat antioxidant system.MethodsA total of 52 3-month-old SD rats were randomly divided into six groups,namely,control,model,Euthyrox,EGCG lowdose（25 mg·kg-1·d-1）,EGCG medium-dose（50 mg·kg-1·d-1）,and EGCG high-dose（100 mg·kg-1·d-1）groups.Except for the control group,131I was intragastrically administered for 2 weeks to the five remaining groups to obtain hypothyroid rats.After the hypothyroid rat model was successfully established,the control and model groups received normal saline,whereas the other groups were treated with appropriate medication.After 4 weeks,the levels of serum-free triiodothyronine three（FT3）,free thyroxine（FT4）,and TSH were detected using a biochemical method.The levels of superoxide dismutase,glutathione peroxidase,and peroxidase were also determined.ResultsThe Euthyrox and EGCG groups exhibited significantly elevated serum FT3and FT4levels compared with the model group.The TSH levels of the Euthyrox and EGCG high-dose groups were significantly reduced.No statistical significance was found in the EGCG low-and middle-dose groups.The superoxide dismutase activity of the Euthyrox and EGCG groups were significantly lower compared with that of the model group,whereas the glutathione peroxidase activity was significantly higher.The catalase levels were also significantly elevated in EGCG medium-andhigh-dose groups.ConclusionEGCG reduced the effect of radiation on the131I oxidative thyroid tissue damage and protected the rat antioxidant system.

Iodine radioisotopes;Radiation injuries;Hypothyroidism;Epigallocatechin gallate; Antioxidant system

2015－01－15）

10.3760/cma.j.issn.1673-4114.2015.04.009

650500昆明，云南中医学院药学院药学专业（陈雪梅）；650500昆明，云南省中西医结合医院内科（周树云，瞿博）；650500昆明，云南中医学院第一附属医院内分泌科（范源）

范源（Email：1647909799@qq.com）；瞿博（Email：1061508680@qq.com）