竹笋壳生物转化木糖醇高产菌株的筛选

祝燕燕，陈显群，杨胜利

（1.浙江工业大学药学院，浙江 杭州 310014；2.温州市食品研究所，浙江 温州 325000）

木糖醇是一种五碳糖醇，甜度与蔗糖相当，同时木糖醇具有较宽的酸pH范围，玻璃化所需温度较低，具有较长时间的储藏和保存的较优性能[1]。木糖醇是所有食用糖醇中生理活性最好的品种，作为一种高效的功能性营养添加剂，它味甜低热，口感清凉，发热与葡萄糖等同[2]。根据文献报道，目前工业化生产低热量、无糖的多元醇甜味剂的需求正在与日俱增，其中木糖醇就是一种重要的替代品，具有优良的生理功能和广泛的应用价值[3]。

传统的木糖醇生产方法是采用化学催化加氢法，该法生产成本高，对环境污染严重[4]。生物转化法一直被认为是一条更为经济的工艺路线，因为发酵生产木糖醇无需木糖纯化步骤，还可以简化木糖醇的分离过程[5]。我国竹类资源十分丰富，全国毛竹林约为240万公顷。目前竹笋壳一般没有利用价值，农民都是任其腐烂。其实竹笋壳富含丰富的半纤维素，其含量为28.12%[6]，用其生产木糖乃至木糖醇将是很好的原料，成本低廉。基于竹笋壳的成分和生物转化法的特点，我们以竹笋壳水解液作为木糖来源发酵生产木糖醇。

1 材料

1.1 菌种

土样来自浙江工业大学小竹林。用无菌小铲子除去表面的土壤，选取离地面5～15 cm处的土壤，小心放入清洁干净的样品袋中，密封好，记录采样的时间、地点以及环境条件。

挑取出现发霉状况的竹笋壳，将其放入粉碎机中粉碎，将碎粒小心放入清洁干净的样品袋中，密封好。

1.2 培养基

种子培养基（g/L）：D-木糖 20，酵母膏 5，磷酸二氢钾2，二水氯化钙0.1，七水硫酸镁 0.2，硫酸铵 5，琼脂 20。

菌种保藏培养基（g/L）：D-木糖 20，酵母膏 5，磷酸二氢钾2，二水氯化钙0.1，七水硫酸镁0.2，硫酸铵5，琼脂20。

发酵培养基（g/L）：竹笋壳水解液（木糖含量20），蛋白胨 10，酵母粉 10。

灭菌条件：木糖与其他营养成分分开灭菌，条件为121℃，20 min。

1.3 菌种的分离纯化

取土样5 g溶于适量的无菌水中进行搅拌，之后取上清液按照稀释法进行适当的稀释，各取稀释梯度为 10-1、10-2、10-3、10-4 、10-5、10-6、l0-7的稀释液0.1 mL分别涂布于细菌选择性培养基中。每个稀释浓度涂3个平板以上，然后将平板放入30℃恒温培养箱培养3～5 d，之后观察菌落的形态和大小，从平板上挑选长得好的大的菌落，进行平板划线分离后再接入斜面进行菌种保藏和初筛分析用。

1.4 菌种的扩大培养

分离纯化得到的优势菌株，取适量接种于含有100 mL种子培养液的250 mL锥形瓶中，平行接种3瓶种子液。在30℃、200 r/min的培养条件下摇床培养2～3 d，根据微生物生长状况适时终止培养，选取长势良好且澄清透明的发酵液作为种子发酵液。

2 方法

2.1 竹笋壳水解液的制备

（1）竹笋壳：来自浙江工业大学北门菜市场，将竹笋壳清洗烘干后，用电动粉碎器粉碎，粉碎粒度100目，半纤维素质量分数为28%。

（2）竹笋壳半纤维素水解：竹笋壳粉末以1:8（质量：体积）的固液比与质量浓度1.0%硫酸混合，121℃下水解1 h。

（3）真空浓缩：水解液离心滤去竹笋壳残渣后，50℃真空浓缩至总还原糖为20%左右。

（4）中和：水解液用固体NaOH过中和至pH 10.0，4500 r/min离心20 min去除沉淀。上清液用浓硫酸回调至pH 5.5。冷藏备用。

2.2 水解液的发酵

在250 mL锥形瓶中加入100 mL发酵培养基，将液体种子以5%的接种量接入发酵培养基中，摇瓶转速200 r/min。30℃发酵48 h后停止摇动，最后进行24 h的木糖醇积累。

2.3 测定方法

2.3.1 木糖浓度测定

取待测品 10 mL，2500 r/min离心 10 min，将上清液适当稀释。在25 mL试管中加入1 mL稀释的上清液于大试管中，加入3 mL的DNS试剂，混匀后在沸水浴中反应5 min，冷却，定容25 mL。在波长540 nm处测量吸光度值，根据标准曲线回归方程计算出样品糖浓度[7]。

2.3.2 木糖醇含量测定

用紫外可见分光光度计法来测定木糖醇的含量。

试剂的配置：试剂a：将0.320 g高碘酸钾溶于100 mL 1%的盐酸中。

试剂b：配置鼠李糖1.11 g/L。

NaSH试剂（需现配现用）：在100 mL 150 g/L的乙酸铵中，分别加入0.2 mL的乙酸及乙酰丙酮。

取适量发酵液，4500 r/min离心15 min，将上清液适当稀释。取1 mL稀释液于小试管中，加入1 mL的试剂a，混匀后在室温下反应10 min，再分别加入2 mL的试剂b和4 mL的NaSH试剂，混合均匀后在53℃水浴中保温15 min，冷却后于412 nm处测定吸光度值[8]。

2.3.3 转化率计算

3 结果与分析

3.1 菌种生长情况

图1是部分菌种划线分离后生长情况。它们是从不同浓度的进行平板涂布的培养基上挑选出来的，长得较大的较好的单菌落。在超净工作台上，将这些单菌落挑选出来，进行划线分离，然后放入恒温培养箱中进行培养。最后在超净工作台上，将以上分离出来的单菌落接到斜面试管中进行菌种的保藏，以备后续试验。

图1 菌种的生长情况Fig 1 The growth situation of strain

3.2 木糖标准曲线

图2 木糖标准曲线Fig 2 Standard curve of xylose

3.3 木糖醇标准曲线

图3 木糖醇标准曲线Fig3 Standard curve of xylitol

3.4 筛选结果

初始培养基的木糖浓度均为20 mg/mL。

发酵液中的木糖醇含量根据木糖醇标准曲线方程式计算，并乘以稀释倍数。

表2 工业应用试验数据表

不同菌种发酵所得到的木糖转化率如表1所示。从表中可以看出，这30个菌株的转化能力各不相同，在取平均值之后，可以看到转化率高的菌株能够达到46.3%，而转化率低的只有23.1%。用自然筛选得到的菌株差异较大，并且为了获得高转化率的菌株需要进行大量的实验积累数据。

4 结论

从发霉竹笋壳及特定土样出发，以竹笋壳水解液为唯一碳源，通过筛选培养基筛选出了能利用木糖生产木糖醇的30株菌株，并通过摇瓶培养后比较木糖转化率得到了高产木糖醇菌株即第3号菌株，其木糖转化率达到46.3%。对竹笋壳的废物利用，绿色环保，并有利于增加农民收入，对其发酵生产木糖醇可进行后续研究。

[1]张凤，张丽君，周长民.木糖醇的特性及应用[J].当代化工， 2008， 37（2）:92-95.

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[3]Swati M.Comparative study on different strategies involved for xylitol purification from culture media fermented by Candida tropicali[J].Separation and Purification Technology， 2011， 78（3）:266-273.

[4]王关斌，赵光辉.木糖醇的生产与发展趋势[J].浙江化工，2005，36（2）:25-26.

[5]赵寿经，候琨，梁彦龙，等.产木糖醇菌株的筛选及发酵条件优化[J].吉林大学学报（工学版），2010，40（3）：868-872.

[6]周晓洁，李建强，陈延兴.竹笋壳化学成分分析[J].武汉科技学院学报，2010，23 （1）:1-3.

[7]王旭，苏桂峰.假丝酵母发酵玉米芯半纤维素水解液生产木糖醇[J].China Brewing， 2009（6）:42-45.

[8]张晓元，王松梅，朱希强，等.热带假丝酵母发酵生产木糖醇的研究[J].食品与药品，2006，8（11）:27-30.