表皮生长因子受体基因表达与甲状腺功能亢进症131I治疗预后的关系

郭坤 高蕊 于燕 刘岩 杨爱民

·论著·

表皮生长因子受体基因表达与甲状腺功能亢进症131I治疗预后的关系

郭坤 高蕊 于燕 刘岩 杨爱民

目的探讨甲状腺功能亢进症（简称甲亢）组织中表皮生长因子受体（EGFR）基因相对表达与131I治疗预后的关系。方法入组拟行131I治疗的59例Graves甲亢患者作为实验组，平均年龄（46.46±12.95）岁，其中男性16例、女性43例；正常对照组27名，平均年龄（44.66± 10.86）岁，其中男性6名、女性21名。入选者采用细针穿刺法获取甲状腺组织，应用荧光实时定量PCR法检测甲亢组织及正常甲状腺组织中EGFR基因的相对表达水平，采用t检验、方差分析及多因素分析探讨EGFR基因相对表达水平与131I治疗预后的关系。结果EGFR基因在正常甲状腺组织及Graves甲亢组织中都有不同程度的表达；甲亢组织中EGFR的相对表达水平明显高于正常甲状腺组织（1.752±0.660 vs.0.859±0.125，t=4.328,P＜0.001）。59例Graves甲亢患者经131I治疗6个月后，失访8例，其中，甲状腺功能减退症（简称甲减）占39.2%（20/51）、完全缓解占41.2%（21/51）、未愈占19.6%（10/51），甲亢治愈率（甲减+完全缓解）为80.4%。未愈组EGFR相对表达水平显著高于治愈组（甲减+完全缓解）（8.092±3.887 vs.1.383±0.160,t=7.647，P＜0.001）；未愈组（8.092±3.887）EGFR相对表达水平高于完全缓解组（1.487±0.479）和甲减组（0.968± 0.180）（t=7.364和8.027,P＜0.001）。Logistic回归分析显示：口服131I剂量（OR=3.456）、甲状腺质量（OR=3.853）及EGFR相对表达水平（OR=1.423）是甲亢患者131I治疗后影响治疗效果的主要因素。结论EGFR基因的相对表达可能是预测甲亢131I治疗近期疗效及预后的指标。

甲状腺功能亢进症；碘放射性同位素；受体，表皮生长因子；预后

131I治疗甲状腺功能亢进症（简称甲亢）的疗效好、复发率低，治愈率高达80%～90%，已成为临床治疗甲亢的主要方法[1]。有学者指出131I治疗甲亢的效果除了与患者病史、性别、年龄、吸碘率、甲状腺质量、有效半减期等有关外，辐射敏感的个体差异性可能起到关键作用。目前研究表明，个体对射线的敏感性是由一系列修复DNA损伤的基因群的表达程度所决定的[2]。其中，表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）是跨膜受体酪氨酸激酶的一种，在调节肿瘤细胞增殖及细胞周期进程中发挥着重要作用[3－4]。有文献报道，EGFR通过参与辐射治疗过程中细胞增殖反应、辐射诱导的DNA损伤修复等途径参与辐射抵抗[5－6]。鉴于外照射与内照射在辐射生物效应方面的相似性，有理由认为EGFR的表达与131I治疗甲亢之间可能存在某些联系，但目前国内外尚未发现EGFR基因表达与131I治疗甲亢疗效关系的相关报道。因此，本研究应用实时定量PCR法检测甲亢组织中EGFR基因的表达，探讨EGFR基因表达与甲亢131I治疗疗效的可能关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料

随机选取西安交通大学第一附属医院核医学科2013年5月至10月59例拟行131I治疗的Graves甲亢患者作为实验组，参照中华医学会内分泌学分会《中国甲状腺疾病诊疗指南》的建议[7]，所有患者均符合Graves甲亢的诊断标准：①临床高代谢的症状和体征；②甲状腺弥漫性肿大，少数患者可无甲状腺肿大；③血清甲状腺激素水平升高，促甲状腺激素水平降低。入选者均除外肝肾疾病、恶性肿瘤及其他传染性疾病，未用其他免疫抑制剂。同时记录患者资料：性别、年龄、病程、甲状腺激素水平、甲状腺球蛋白抗体、甲状腺微粒体抗体、24 h甲状腺最高摄碘率、甲状腺有效半衰期、甲状腺质量、口服131I剂量等。同期选择志愿者27名作为正常对照组，入选者排除任何甲状腺疾病。所有入选患者及志愿者均采用细针穿刺法获取甲状腺组织，标本均经病理确诊后置于－80℃冰箱冻存用于RNA的提取。所有研究对象均被告知并签署知情同意书。

实验组患者年龄18～70岁，平均（44.66±12.94）岁，其中，男性占27.1%（16/59），女性占72.9%（43/59）；对照组年龄20～80岁，平均（44.64±14.27）岁，其中，男性占22.2%（6/27），女性占77.8%（21/ 27），两组之间性别、年龄无差异。

1.2 总RNA的提取及荧光实时定量PCR

根据Trizol Reagant试剂盒（TaKaRa公司，中国大连）说明书的步骤提取总RNA，溶于经焦碳酸二乙酯（上海生工生物工程有限公司，中国）处理的去离子水中，－80℃保存备用。应用Quawell超微量紫外分光光度计（北京鼎国昌盛生物技术有限公司，美国）检测RNA的浓度及纯度。OD280/260在1.8～2.0为合格。逆转录反应采用反转录试剂盒（Fermentas公司，中国上海），按说明书操作，反应总体系为10μl，其中，总RNA 500 ng，Prime Script RT Enzyme Mix 0.5 μl，5×Prime Script buffer 2 μl，Oligo dT Prime 0.5 μl，Random 6mers 0.5 μl，RNase Free ddH2O加至10 μl。反应条件为：37℃15 min，85℃5 s，4℃5 min。合成完成后－20℃保存备用。采用SYBR Premix Ex TaqTMII试剂盒（TaKaRa公司，中国大连），按说明书进行操作，反应体系：SYBR Premix Ex TaqTM（TaKaRa公司，中国大连）12.5 μl，上、下游引物各1 μl（引物序列：EGFR：5’-ATCATACGCGGCAGGACCA-3’和5’-TCTGACCGGAGGTCCCAAAC-3’，β-actin：5’-ATCATACGCGGCAGGACCA-3’和5’-TCTGACCGGAGGTCCCAAAC-3’），引物由大连宝生物有限公司合成，cDNA2 μl，ddH2O 8.5 μl，总体积25 μl。反应条件为：95℃30s，95℃5s，60℃30s，40个循环。反应结束后读取各个基因的循环阈值，即Ct值，按2－ΔΔCt法计算EGFR mRNA的相对含量。每个实验组设3个复孔，所有实验数据均在相同条件下重复3次得到。

1.3 治疗及随访

患者停用影响甲状腺摄取131I的药物和禁食含碘食物两周以上；进行详细而全面的体格检查、血常规检查及肝肾功能检查，完成甲状腺功能检查、甲状腺自身抗体测定和甲状腺吸碘率试验。患者治疗剂量采用计算剂量法确定，口服131I前至少禁食2 h，治疗后纳入随访。疗效判断标准：①完全缓解：甲状腺毒症的症状和体征消失，血中甲状腺激素及促甲状腺激素恢复到正常水平；②好转：患者的甲亢症状减轻，体征未完全消失，血中甲状腺激素未降至正常范围或降至正常范围又上升超过正常值；③无效：患者的甲亢症状和体征无变化或反而加重，甲状腺体积未见缩小，血清甲状腺激素一直高于正常水平；④甲状腺功能减退症（简称甲减）：患者出现甲减的症状和体征，血清甲状腺激素低于正常水平。将所有回访的51例患者按上述疗效评价标准分组。分组方案1：治愈组（完全缓解+甲减）、未愈组（好转+无效，即随访截止时仍为甲亢的患者）；分组方案2：未愈组（好转+无效）、完全缓解组及甲减组。

1.4 统计学分析

应用SPSS 17.0软件进行统计学分析。两组计量资料进行独立样本t检验，3组剂量资料间比较采用方差分析，多因素分析采用向后逐步筛选变量法Logistic回归判别分析检验结果。P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

59例甲亢患者经131I治疗后6个月，失访8例，其余患者中，甲减占39.2%（20/51），完全缓解占41.2%（21/51），未愈占19.6%（10/51），甲亢治愈率（甲减+完全缓解）为80.4%（41/51）。

2.1 EGFR基因表达水平与治疗效果间的关系

EGFR在正常甲状腺组织及甲亢患者组织中都有不同程度的表达。甲亢患者组织中EGFR的相对表达水平明显高于正常组织（1.752±0.660 vs.0.859± 0.125，t=4.328，P＜0.001）。所有患者采用计算剂量法一次性口服131I治疗随访6个月后，根据分组方案1：未愈组EGFR相对表达水平显著高于治愈组（8.092±3.887 vs.1.383±0.160，t=7.647，P＜0.001）。根据分组方案2：未愈组（8.092±3.887）EGFR相对表达水平高于完全缓解组（1.487±0.479）和甲减组（0.968±0.180）（t=7.364和8.027，P＜0.001）。完全缓解组EGFR相对表达水平高于甲减组（1.487± 0.479 vs.0.968±0.180，t=1.427，P＞0.05），差异无统计学意义。

2.2 多因素分析

将性别、年龄、病程、甲状腺激素水平、甲状腺球蛋白抗体、甲状腺微粒体抗体、24 h甲状腺最高摄碘率、甲状腺有效半衰期、甲状腺质量、口服131I剂量等临床特征量化，并将EGFR相对表达量作为因变量，是否治愈作为结果变量引入多因素方程，应用逐步向后剔除法筛选变量，对全部原因变量进行Logistic回归分析，结果被引入回归方程的影响因素只有EGFR、131I剂量和甲状腺质量（表1）。

表1 Logistic回归方程中的变量和常数Table 1 Variables and constants in the logistic regression equation

3 讨论

131I治疗甲亢患者已达数百万例，治愈率高达80%～90%。因131I治疗甲亢安全有效、简便经济、不良反应小，此方法已被越来越多的内科医生及患者认可。为提高131I治疗疗效，国内外学者已做了大量研究，但因患者年龄、性别、甲状腺大小、摄碘率及服用抗甲状腺药物等多种因素均可能影响甲亢的治疗效果，在考虑以上因素并使用同一标准的情况下，依然有部分患者出现甲减，另有患者存在仍未治愈的情况，因此，我们推测甲亢的131I治疗效果可能与个体的放射敏感性有关，而个体放射敏感性的不同是由特异性的基因决定的，所以会导致患者接受131I治疗的反应不一，疗效各异。

EGFR是一种细胞膜受体，具有酪氨酸蛋白激酶的活性，能够促进上皮细胞的增生；在一定条件下，EGFR可能存在自身启动从而导致细胞的异常增生，并在细胞的转化中发挥重要作用[8]。Marti等[9]通过免疫组化的实验方法指出核表皮生长因子及其受体在Graves甲亢组织中的表达水平明显高于正常组织。本研究通过实时定量PCR方法与其得出一致的实验结果，提示EGFR在甲亢的发生及发展中起着重要的生长调节作用。肿瘤细胞对放疗的反应取决于治疗期间其诱导的增殖反应、修复辐射引起DNA损伤的能力以及诱导肿瘤细胞缺氧的能力[10]。EGFR通过对下游通路的活化参与内源性DNA修复机制和肿瘤细胞的增殖过程，缺氧可通过自分泌途径诱导EGFR及其配体的表达，且EGFR可以稳定缺氧反应的关键蛋白缺氧诱导因子。总之，EGFR参与了辐射抵抗的各个方面[11]。有研究发现了EGFR的高表达与临床预后差之间的相关性，临床实验包括155例头颈部肿瘤患者，显示EGFR的表达可作为局部放射治疗强大而独立的预后指标[12]；此外，对喉癌患者的研究表明，EGFR表达低的肿瘤组织放射治疗的效果明显改善[13]。再者，一个经典的剂量分割实验表明，EGFR阻滞剂可导致从细胞核到细胞质的DNA依赖性蛋白激酶再分配，从而减少辐射引起DNA损伤的修复，因而起到放射增敏作用[14]。目前国内外尚无关于EGFR基因表达与甲亢131I内照射治疗疗效关系的研究报道。本研究结果显示，未愈组EGFR表达水平显著高于治愈组，而且也明显高于完全缓解组和甲减组，且完全缓解组EGFR表达水平高于甲减组，此研究结果提示131I治疗甲亢过程中EGFR高表达者对131I的敏感性较低，治疗效果相对较差。

本研究还探讨了EGFR基因的表达及临床特征（如年龄、性别、甲状腺质量等）对治疗效果的综合影响，所有患者在131I治疗后6个月根据治疗效果分为治愈组（即完全缓解及甲减患者）和未愈组（即需要二次治疗的患者，包括好转及无效患者）两组，将前述影响因素与是否治愈这一结果进行分析，采用多因素成组资料逐步筛选变量法拟合Logistic回归方程，得到与131I治疗效果的相关因素。其中，EGFR、甲状腺质量这2个因素的回归系数为正值，表明随着这些因素量值的递增，甲亢患者未愈的可能性增加，为危险因素；而给予131I剂量的回归系数为负值，表明伴有这一因素的甲亢患者治疗后未愈的可能性减少。而性别、年龄、病程、甲状腺球蛋白抗体、甲状腺微粒体抗体、24 h甲状腺最高摄碘率、甲状腺有效半衰期未纳入多因素方程。Chiovato等[15]观察了Graves甲亢患者经131I治疗后1年内（1、3、6、12个月后）血甲状腺刺激性抗体、抗甲状腺激素抗体水平及超声检查甲状腺体积的变化，发现治疗前未愈组、完全缓解组的甲状腺体积显著大于早发甲减组，因此认为早期甲状腺功能取决于治疗前甲状腺体积和甲状腺的缩小程度。谭建等[16]对310例接受131I治疗的Graves病患者进行综合分析发现，在各项131I治疗Graves病后早发甲减的相关因素中，治疗前甲状腺质量、每克甲状腺组织给予131I的平均剂量、甲状腺最高摄碘率均可影响治疗效果。但也有研究者发现131I治疗效果与甲亢患者的甲状腺体积、甲状腺功能状态、131I剂量、年龄、性别均无关[17-18]。本研究发现给予131I剂量及甲状腺质量可以影响甲亢131I的治疗效果，但本研究拟主要探讨EGFR对甲亢131I治疗效果的影响，由于细针穿刺甲亢组织较难获得，所以样本量较少，有待收集大样本资料后进行进一步的探讨。

［1］Nygaard B,Hegedüs L,Gervil M,et al.Influence of compensated radioiodine therapy on thyroidvolume and incidence of hypothyroidism in Graves′disease[J].J Intern Med,1995,238（6）：491-497.

［2］Farkasova T,Gurska S,Witkovsky V,et al.Significance of amino acid substitution variants of DNA repair genes in radiosusceptibility of cervical cancer patients;a pilot study[J].Neoplasma,2008,55（4）：330-337.

［3］Wang H,Zhu L,Gao J,et al.Promotive role of recombinant HE4 protein in proliferation and carboplatin resistance in ovarian cancer cells[J].Oncol Rep,2015,33（1）：403-412.

［4］Jorissen RN,Walker F,Pouliot N,et al.Epidermal growth factor receptor：mechanisms of activation and signalling[J].Exp Cell Res,2003,284（1）：31-53.

［5］Toulany M,Kasten-Pisula U,Brammer I,et al.Blockage of epidermal growth factor receptor-phosphatidylinositol 3-kinase-AKT signaling increases radiosensitivity of K-RAS mutated human tumor cells in vitro by affecting DNA repair[J].Clin Cancer Res,2006,12（13）：4119-4126.

［6］Meijer TW,Kaanders JH,Span PN,et al.Targeting hypoxia,HIF-1, and tumor glucose metabolism to improve radiotherapy efficacy[J]. Clin Cancer Res,2012,18（20）：5585-5594.

［7］中华医学会内分泌学分会《中国甲状腺疾病诊治指南》编写组.中国甲状腺疾病诊治指南——甲状腺功能亢进症[J].中华内科杂志,2007,46（10）：876-882.

［8］Asami K,Atagi S.Epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitors for non-small cell lung cancer[J].World J Clin Oncol, 2014,5（4）：646-659.

［9］Marti U,Ruchti C,Kämpf J,et al.Nuclear localization of epidermal growth factor and epidermal growth factor receptors in human thyroid tissues[J].Thyroid,2001,11（2）：137-145.

［10］Bussink J,van der Kogel AJ,kaanders JH.Activation of the PI3-K/ AKT pathway and implications for radioresistance mechanisms in head and neck cancer[J].Lancet Oncol,2008,9（3）：288-296.

［11］Nijkamp MM,Span PN,Terhaard CH,et al.Epidermal growth factor receptor expression in laryngeal cancer predicts the effect of hypoxia modification as an additive to accelerated radiotherapy in a randomised controlled trial[J].Eur J Cancer,2013,49（15）：3202-3209.

［12］Ang KK,Berkey BA,Tu X,et al.Impact of epidermal growth factor receptor expression on survival and pattern of relapse in patients with advanced head and neck carcinoma[J].Cancer Res,2002,62（24）：7350-7356.

［13］Maurizi M,Almadori G,Ferrandina G,et al.Prognostic significance of epidermal growth factor receptor in laryngeal squamous cell carcinoma[J].Br J Cancer,1996,74（8）：1253-1257.

［14］Huang SM,Harari PM.Modulation of radiation response after epidermal growth factor receptor blockade in squamous cell carcinomas：inhibition of damage repair,cell cycle kinetics,and tumor angiogenesis[J].Clin Cancer Res,2000,6（6）：2166-2174.

［15］Chiovato L,Fiore E,Vitti P,et al.Outcome of thyroid function in Graves′patients treated with radioiodine：role of thyroid-stimulating and thyrotropin-blocking antibodies and of radioiodine-induced thyroid damage[J].J Clin Endocrinol Metab,1998,83（1）：40-46.

［16］谭建,王澎,张丽娟,等.131I治疗Graves病后早发甲低相关因素的综合分析[J].中华核医学杂志,2005,25（6）：325-328.

［17］Zanotti-Fregonara P,Hindié E.On the effectiveness of recombinant human TSH as a stimulating agent for131I treatment of metastatic differentiated thyroid cancer[J].Eur J Nucl Med Mol Imaging, 2010,37（12）：2264-2266.

［18］Erem C,Kandemir N,Hacihasanoglu A,et al.Radioiodine treatment of hyperthyroidism：prognostic factors affecting outcome[J]. Endocrine,2004,25（1）：55-60.

The relationship between epidermal growth factor receptor mRNA expression and the efficacy of131I treatment in hyperthyroidism patients

Guo Kun*，Gao Rui，Yu Yan，Liu Yan，Yang Aimin. *Department of Nuclear Medicine，the First Affiliated Hospital，Medical School of Xi’an Jiaotong University，Xi’an 710061,China

Yang Aimin,Email：yangaimin@mail.xjtu.edu.cn

ObjectiveTo study the relationship between the epidermal growth factor receptor（EGFR）mRNA expression and the efficacy of131I treatment in hyperthyroidism patients.MethodsFine needle biopsies of 59[the male to female ratio was 16∶43;mean age was（46.46±12.95）years old]Graves disease patients and 27[the male to female ratio was 6∶21;mean age was（44.66±10.86）years old]normal volunteers were collected.The mRNA expression of EGFR was detected by real-time polymerase chain reaction before treatment.T-test,analysis of variance and multivariate logistic regression analysis were applied to analyze the relationship between EGFR mRNA expression and the efficacy of131I treatment.ResultsCompared with normal group,the mRNA expression level of EGFR was significantly higher in Graves disease patients（1.752±0.660 vs.0.859±0.125,t=4.328,P＜0.001）.Six months after131I treatment, except 8 cases were lost in following up,all of the remain 51 eligible evaluated patients were relieived from hyperthyroidism.Among them,80.4%of patients was cured,39.2%（20/51）became hypothyroid,41.2%（21/51）became euthyroid,and 19.6%（10/51）remained hyperthyroid.The EGFR mRNA expression wassignificantly higher in uncured group than in cured group（8.092±3.887 vs.1.383±0.160，t=7.647,P＜0.001）.The EGFR mRNA expression was significantly higher in uncured group（8.092±3.887）than in euthyroid（1.487±0.479）or hypothyroid group（0.968±0.180）（t=7.364 and 8.027,P＜0.001）.Multiple logistic regression revealed that the radioiodine dosage（OR=3.456），thyroid weight（OR=3.853）and EGFR mRNA expression（OR=1.423）was related to the efficacy of131I treatment.ConclusionEGFR mRNA expression may be used in evaluating the prognosis of hyperthyroidism patients after131I treatment.

Hyperthyroidism;Iodine radioisotopes;Receptor,epidermal growth factor;Prognosis

2014-11-06）

10.3760/cma.j.issn.1673－4114.2015.01.003

国家自然科学基金（81172598）；陕西省自然科学基金（2010JM4037）

710061，西安交通大学第一附属医院核医学科（郭坤，高蕊，刘岩，杨爱民）；710061，西安交通大学医学院公共卫生学院（于燕）

杨爱民（Email：yangaimin@mail.xjtu.edu.cn）