人血清白蛋白诱导人肾小管上皮细胞对Egr-1表达的影响*

吴丹彤 李均 姚兰

终末期肾衰竭是各种慢性肾脏病的晚期，而肾间质纤维化（Renal interstitial fibrosis，RIF）是所有慢性肾脏疾病进展至终末期肾病的共同途径。蛋白尿是多种肾脏疾病常见的症状，是肾小球疾病中最常见的临床表现之一，其不仅反映肾小球损伤的程度，且大量实验研究表明，蛋白尿是慢性肾病进展的独立致病因素[1]。研究发现，尿蛋白的主要成分是白蛋白，对近端肾小管上皮细胞存在直接损害作用，白蛋白过度重吸收与肾小管上皮细胞增殖、凋亡失衡以及表型转分化等有密切关系[2]。因此，蛋白尿是公认的能反映多种肾脏病预后的因素，也是引起小管间质损伤及肾脏疾病的重要因素。早期生长反应因子（Early growth response gene-1，Egr-1）能被低氧、缺血、多肽生长因子及尿素等多种刺激因素诱导，并能调控下游多种基因的表达，参与细胞的生长、分化、增殖和凋亡[3]。Egr-1可通过促进转化生长因子-β（TGF-β）表达，细胞外基质（ECM）积聚进一步参与肾纤维化[4-5]。本研究拟观察人血清白蛋白超载人肾小管上皮细胞（HK-2）对Egr-1表达的影响，以进一步探讨白蛋白对HK-2的损害机制。

1 材料与方法

1.1 材料 人肾小管上皮细胞购自广州凯基，胎牛血清（Gibco公司），RPMI-1640培养基（Gibco公司），人血清白蛋白（纯度98%、Sigma公司），小鼠抗人Egr-1单克隆抗体（Abcam：产品编号ab55160），SDS电泳凝胶试剂盒、BCA蛋白检测盒、ECL化学发光底物、羊抗小鼠二抗（均购自武汉博士德），脱脂奶粉（购自Sigma，美国）。

1.2 主要仪器 SW-CJ-2F（标准型）双人双面垂直工作台；二氧化碳培养箱（HF90）；台式高速冷冻离心机（D37520） Thermo Fisher，德国；DY-CZ-24D型电泳槽，北京市六一仪器厂；DYY-2C型电泳仪，北京六一仪器厂；半干转印仪，美国BIO-RAD。

1.3 方法

1.3.1 细胞培养及分组 将HK-2细胞于含10%胎牛血清1640培养基、培养条件5% CO2，37 ℃培养。每2~3天换液1次，每3~5天传代1次。镜下观察细胞生长至90%~95%融合时，用0.25%胰酶消化后，待镜下观察细胞间隙增大后移除胰酶加入含10%胎牛血清1640培养液终止消化，按1∶2~1∶3传代。待细胞长至90%~95%融合时，用无血清培养基同步化24 h。细胞随机分为A、B、C、D四组并分别给予不同浓度的人血清白蛋白培养，A组浓度为0 mg/mL、B组浓度为10 mg/mL、C组浓度为20 mg/mL、D组浓度为40 mg/mL，实验分别观察24、48和72 h。

1.3.2 观察指标及方法 免疫印迹检测Egr-1的表达：HK-2细胞经药物处理后分别于24、48和72 h收集细胞，用4 ℃预冷的PBS漂洗3次，加入100 μL细胞裂解液（每1 mL裂解液内含10 μL蛋白酶抑制剂），冰上裂解30 min后刮下细胞，收集于1.5 mL EP管中，于4 ℃、12 000 r/min离心15 min后，取上清液，BCA蛋白检测试剂盒测定蛋白浓度。蛋白变性后于10%聚丙烯酰胺凝胶中电泳分离，电泳完毕后用BIO-RAD半干转印仪将蛋白转移至0.45 μm NC膜上。5%脱脂奶粉室温封闭90 min后，先用小鼠抗人Egr-1单克隆抗体（Abcam公司，1∶200稀释）4 ℃孵育过夜，TBST缓冲液洗4次，洗膜10 min/次，再加入羊抗小鼠IgG抗体（博士德公司，1∶3000稀释）室温下孵育2 h，最后经ECL化学发光底物在X片上显色并曝光成像，扫描X光片结果条带后，Image-Pro Plus 6.0测定光密度值，使用特异性基因光密度/管家基因光密度（42KD β-actin）相对定量比较。

1.4 统计学处理 使用SPSS 16.0统计软件进行分析，每组实验分别重复3次，计量资料采用（s）表示，多组资料间比较采用单因素方差分析，LSD法检验比较组间差异，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

人血清白蛋白对肾小管上皮细胞Egr-1蛋白表达的影响如下：表1示24 h时与A组比较，B、C、D组Egr-1蛋白相对表达均有不同程度升高，其中B、C组差异无统计学意义（P>0.05），D组Egr-1相对表达显著升高，差异有统计学意义（P<0.05）；48、72 h与A组比较，B、C、D组Egr-1相对表达均有不同程度升高，其中B组差异无统计学意义（P>0.05），C、D组Egr-1相对表达均显著升高，差异有统计学意义（P<0.05）。说明药物组Egr-1相对表达随人血清白蛋白浓度增加及时间延长呈逐渐增加趋势，见图1。

表1 人血清白蛋白对肾小管上皮细胞Egr-1/β-catenin表达的影响

图1 人血清白蛋白对肾小管上皮细胞Egr-1、β-catenin蛋白表达的影响

3 讨论

RIF是慢性肾脏病发展成终末期肾病的主要病理基础，是各种肾脏疾病进展至终末期肾功能衰竭的共同途径，是临床加重慢性肾衰进程的重要环节[6]。蛋白尿是肾脏损伤的重要标志，蛋白尿的程度是预测多种肾脏疾病严重性和恶化趋势的重要指标，同时蛋白尿也作为一个独立的致病因素参与肾脏疾病进展[7]。体外实验表明，蛋白尿的主要成分白蛋白是促肾小管间质纤维化的主要因素，超负荷的尿蛋白转运至肾小管中会引起肾间质炎症和免疫反应的发生，可介导白介素-8（IL-8）、单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）、TGF-β及一氧化氮等因子表达，这些因子在促进肾小管间质损害中起重要作用[8-9]。肾小管上皮细胞转分化（TMET）是肾小管间质纤维化的病理基础，实验表明白蛋白可诱导TGF-β、整合素连接激酶（ILK）、α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、钙粘附蛋白E（E-cadherin）及纤连蛋白（FN）mRNA表达，诱导TMET发生，进而参与致肾小管间质纤维化的发生发展[10-11]。此外，白蛋白还可能通过促进Ⅳ型胶原（col-Ⅳ）的合成及上调基质金属蛋白酶组织抑制剂-1（TIMP-1）、基质金属蛋白酶-9（MMP-9）使ECM积聚，进一步参与肾间质纤维化[12]。白蛋白可通过ERK、TGF-β1/Smad、Akt、Notch等信号通路而参与肾纤维化发生发展[13-16]。

早期生长反应因子（Early growth response gene-1，Egr-1）又称为NFGI-A、Krox24、TIS8等，是一种具有锌指结构的转录因子，是即刻早期基因（immediate early gene）家族成员之一，该家族包括Egr-1、Egr-2、Egr-3、Egr-4、c-Jun等 30多种成员[3]。Egr-1在肾脏的肾小球系膜细胞、内皮细胞、肾小管成纤维细胞及上皮细胞均可检测到表达，诱导表达后可调控包括血小板衍生生长因子（PDGF-C）、细胞间黏附分子-1、TGF-β等一系列基因的表达，参与细胞的生长、分化、增殖、凋亡以及肿瘤的发生[4-5]。很多学者均认为，Egr-1参与了肾组织纤维化的发生发展[17-20]。TGF-β是公认的致纤维因子，其可通过Smad通路，诱导Egr-1 mRNA和蛋白表达，且表达的TGF-β本身又可作为刺激源激活Egr-1表达，可推测TGF-β可引发Egr-1的促纤维化反应。在UUO模型中，将DNA酶导入成纤维细胞内，可下调TGF-β、α-SMA、FN和Ⅰ型胶原（col-Ⅰ）mRNA表达，抑制肌成纤维细胞形成，起到抗肾间质纤维化的作用[21]。实验表明，激活细胞外信号调节激酶/丝裂原活化蛋白激酶（Erk/MPARK）信号途径可使Egr-1转入细胞内，导致PDGF-C表达增加，进而促进肾纤维化的发展[22]。此外，Egr-1通过介导细胞凋亡、诱导成纤维细胞生成、细胞外基质聚积等参与肾纤维化，因此Egr-1可能是器官纤维化发病机制中的重要环节[23]。

本实验采用人血清白蛋白干预HK-2细胞24、48、72 h时，发现各个时间段EGR-1表达均增加，但在40 mg/mL人血清白蛋白刺激时可稳定使EGR-1表达明显增加，因此推断人血清白蛋白有可能通过上调Egr-1表达，促进肾间质纤维化。综上所述，人血清白蛋白在一定范围内能以剂量和时间依赖方式诱导培养的肾小管上皮细胞诱导Egr-1蛋白表达增加。

[1]胡光华.白蛋白对大鼠肾脏功能及整合素连接激酶、整合素β1和α-辅肌动蛋白-4的影响[D].济南：山东大学，2013.

[2]黄翀，胡炜华，秦晓华，等.ERK通路抑制剂对白蛋白诱导的人近端肾小管上皮细胞细胞外基质合成的影响[J].山东医药，2011，51（31）：32-34.

[3]朱涛涛，朱宇旌，张勇，等.早期生长反应因子-1生物学特性及功能[J].动物营养学报，2013，25（4）：685-691.

[4]王丹，关美萍，薛耀明，等.早期生长反应因子-1与糖尿病肾病[J].国际内分泌代谢杂志，2014，34（6）：397-400.

[5] Shin S Y，Kim J H，Baker A，et al.Transcription factor Egr-1 is essential for maximal matrix metalloproteinase-9 transcription by tumor necrosisfactor alpha[J].Mol Cancer Res，2010，8（4）：507-519.

[6]李均，曹轶璇，王冬，等.黄芪-丹参药对干预梗阻大鼠肾小管上皮细胞转分化的研究[J].中国实验方剂学杂志，2011，17（19）：195-198.

[7]赖小希，丁国华，贾汝汉，等.白蛋白诱导的鼠肾小管细胞凋亡与牛磺酸的抗凋亡作用[J].中国中西医结合肾病杂志，2009，10（2）：105-108.

[8]王允亮，张昱，王洪霞，等.蛋白尿肾脏毒性发生机制的研究概况[J].世界中西医结合杂志，2010，5（5）：454-456.

[9]孙良忠，Ibrini Juma，Parker Emma，等.白蛋白刺激肾小管上皮细胞表达基质金属蛋白酶2和9[J].中华肾脏病杂志，2007，23（8）：519-523.

[10]秦艳东，秦晓华，房向东，等.ILK在白蛋白诱导人HK-2细胞转分化中的表达和意义[J].南昌大学学报（医学版），2013，53（12）：21-25.

[11]金国华，秦晓华，秦艳东，等.大黄素对人白蛋白诱导人肾小管上皮细胞转分化的影响[J].天津医药，2013，41（1）：26-28.

[12]黄翀，胡炜华，秦晓华，等.人血清白蛋白对HK-2细胞col-Ⅳ、TIMP-1、MMP-9 mRNA表达水平的影响[J].南昌大学学报（医学版），2010，50（3）：20-24.

[13]秦晓华，刘冬兰，何丹，等.ERK通路抑制剂对白蛋白诱导人近端肾小管上皮细胞细胞外基质合成的影响[J].南昌大学学报（医学版），2013，53（11）：1-5.

[14]金国华，秦晓华，秦艳东，等.TGF-β1/Smad信号通路在大黄素干预人肾小管上皮细胞转分化中的作用[J].实用医学杂志，2012，28（1）：36-38.

[15]杨玲，高苹，司晓芸，等.Akt信号通路对肾小管上皮细胞分泌核因子-κB的影响[J].中华急诊医学杂志，2011，20（2）：173-176.

[16]何攀，丁雪冰，朱清，等.Notch信号通路抑制剂对白蛋白诱导的肾小管上皮细胞凋亡的保护作用[J].中华肾脏病杂志，2013，29（12）：934-935.

[17] Gil N， Goldberg R， Neuman T， Garsen M， et al.Heparanase is essential for the development of diabetic nephropathy in mice[J].Diabetes，2012，61（1）：208-216.

[18] Friedrich B， Janessa A， Artunc F，et al.DOCA and TGF-beta induce early growth response gene-1 （Egr-1） expression[J].Cell Physiol Biochem，2008，22（5-6）：465-474.

[19]刘洁，候明辉，刘莉，等.EGR-1基因转染对环境中小鼠肾小球系膜细胞TGF-β及PDGF-B表达的影响[J].中国免疫学杂志，2012，28（6）：497-501.

[20] Bhattacharyya S，Fang F，Tourtellotte W，et al.Egr-1： new conductor for the tissue repair orchestra directs harmony （regeneration） or cacophony （fibrosis）[J].J Pathol，2013，229（2）：286-297.

[21]郭碧林，朱春玲.Egr-1蛋白、MMP-2、TGF-β1在肾小管间质纤维化大鼠中的表达及意义[J].中国现代医学杂志，2013，23（7）：27-33.

[22] Reigstad L J，Varhaug J E，Lillehaug J R.Structural and functional specificities of PDGF-C and PDGF-D， the novel members of the platelet-derived growth factors family[J].FEBS Journal，2005，272（22）：5723-5741.

[23] Lee C G，Cho S J，Kang M J，et al.Early growth response gene 1-mediated apoptosis is essential for transforming growth factor beta1-induced pulmonary fibrosis[J].J Exp Med，2004，200（3）：377-389.