大鼠弥漫性轴索损伤后皮层和脑干Homer1a蛋白的变化及意义

刘伟 张磊 郭庆东 贺亚龙 费舟

·基础研究·

大鼠弥漫性轴索损伤后皮层和脑干Homer1a蛋白的变化及意义

刘伟 张磊 郭庆东 贺亚龙 费舟

目的研究侧向旋转致大鼠脑弥漫性轴索损伤后皮层和脑干Homer1a蛋白表达规律及其意义。方法SD大鼠110只，体重(200±20)g，分为对照组和弥漫性轴索损伤(DAI)组，DAI组应用侧向旋转DAI致伤模型，对照组不予以旋转致伤，其余处理同DAI组，分别在伤后10 min，30 min，1 h，6 h，12 h，24 h，48 h，72 h取大鼠皮层和脑干组织进行Homer1a蛋白分子的免疫组织化学和免疫印迹分析检测。结果两种检测方法发现皮层Homer1a蛋白自伤后30 min起表达，脑干Homer1a自伤后10 min就开始表达，均持续至72 h，皮层各时间点Homer1a表达均弱于脑干组织，而对照组未见该蛋白阳性表达。结论大鼠脑弥漫性轴索损伤后Homer1a蛋白的表达在皮层和脑干组织表达程度有显著性差异，提示DAI后主要以脑干损伤较为严重，Homer1a蛋白分子参与了神经元损伤后脑保护过程。

Homer蛋白； 免疫组织化学； 免疫印迹技术； 弥漫性轴索损伤

脑弥漫性轴索损伤 (diffuse axonal injury，DAI)在重型颅脑损伤中占28%～42%，死亡率高达42%～62%[1-2]。尸检肉眼观察无明显占位病变，光镜下可见胼胝体、脑干上端、大脑白质等部位广泛的神经轴索肿胀、断裂并出现轴缩球。故DAI是以脑深部神经轴索变化为病理特征的脑损伤，目前已被视为一种独立的脑损伤类型，但发病机理尚不完全清楚[3]。Homer蛋白是新近发现的一组信号调节蛋白，它可以特异性的和代谢性谷氨酸受体1a结合，调控蛋白质在细胞内的分布，在神经元损伤中可能发挥重要作用。其中Homer1a在脑损伤前后发生明显变化，而Homer1b/c，Homer2，Homer3表达无明显变化。认为Homer1a在脑损伤后神经元的保护过程中起重要作用[4-5]。本实验通过大鼠头颅瞬间侧向旋转致DAI后大脑皮层和脑干Homer1a蛋白的变化对DAI的发病机制进行研究。

材料和方法

一、材料

健康成年雄性SD大鼠90只，体质量为 (200± 20)g，第四军医大学动物实验中心提供。各Homer蛋白亚型的多克隆抗体均购自SantaCruz公司。兔血清封闭液，兔抗羊免疫组化试剂盒，3，3-二氨基联苯胺(3，3-diaminobenzidine，DAB)显色试测盒，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳 (sodium dodecyl sulfatcpolyaery lamideSDS-PAGE)低分子量标准蛋白及 5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸钾苯胺/硝基四唑蓝(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate toluidine/nitroblue tetrazolium，BCIP/NBT)显色试测盒购自武汉博士德公司。

二、方法

1.动物分组及模型制作。SD大鼠随机分为对照组10只，损伤组据标本采集时间又分为10 min，30 min，1 h，6 h，12 h，24 h，48 h，72 h等每组10只。损伤模型采用贺晓生[6]大鼠头颅瞬间侧向旋转模型，对照组作麻醉后上侧向旋转机器但不致损伤。

2.取材。各组大鼠至预定时间后常规麻醉，每组中随机取5只行4%多聚甲醛灌注固定后取脑组织常规脱水，透明，石蜡包埋，连续切片，待免疫组化检测。另外5只断头取脑，选取皮层，脑干分别提取组织，多去污剂裂解缓冲液于匀浆器内裂解匀浆，匀浆液高速离心(12 000 r/min，15 min)后取上清液冷冻保存，待分别进行Homer1a，Homer1 b/c蛋白免疫印记检测。

3.统计学分析 使用灰度比较软件比较蛋白免疫印记结果，所有数据以x±s表示，以统计软件SPSS12.0做双例t检验，以P＜0.05作为差异显著水准。

结果

免疫印迹分析发现大鼠皮层脑组织和脑干组织中有Homer1a及Homer1b/c蛋白分子的阳性表达，其中皮层组织Homer1a分子于DAI后30 min起出现，持续伤后72 h，脑干组织Homer1a分子于DAI后10 min起出现，持续伤后72 h，而Homer1b/c分子于对照组和DAI组个时间点均可见阳性表达。

免疫组化染色发现Homer1a和Homer1b/c蛋白分子阳性染色结果在皮层和脑干均有分布，其信号均为棕黄色，两者在胞核均未见阳性结果(图1)。 DAI后Homer1a分子在皮层较脑干出现较晚，对照组未见阳性表达Homer1a。Homer1b/c分子在对照组和DAI组均可见阳性表达。

图1 DAI大鼠伤后脑干Homer1a阳性神经元的表达(SABC法，×200)

讨论

Homer蛋白是新近发现的一组信号调节蛋白，它可以特异性的和代谢性谷氨酸受体1a结合，调控蛋白质在细胞内的分布，在神经元损伤中可能发挥重要作用[7]。Homer蛋白家族目前已发现homer1、homer2、homer3，3类共 17种蛋白。其中 Homer1 mRNA剪切后表达产生1a、1b、1c3种蛋白[8]。前期实验研究体外培养神经元机械损伤后homer1a表达明显升高，而homer1b/c，2a/b和3表达无明显变化[4-5]。Homer1a分子属于短Homer蛋白，N-末端包含一个EVH1同源结构域，可以和代谢型谷氨酸受体(metabotropic glutamate receptor，mGluRs)及三磷酸肌醇受体 (inositol trisphosphate receptor，IP3R)相结合。Homer1b/c属于长Homer蛋白，N-末端也含有EVH1同源结构域，其C-末端还有一个长的氨基酸链形成卷曲螺旋二级结构，可以形成同源或异源性的Homer蛋白二聚体[9]。大鼠弥漫性脑损伤后皮层内mGluR1a变化最为明显，是加重神经元损伤的主导因素。而该受体在没有激动剂存在下仍可以介导细胞内IP3的升高及Ca2+依赖的 K+通道的开放。Homer1b/c的 CC螺旋结构形成多具体，连接mGluRs和IP3R分子，使刺激信号很快通过这种连接激活IP3R引起细胞内Ca2+的释放，导致神经元细胞进一步损伤。而Homer1a表达受多种刺激因素调控，他可以选择性阻断Homer1b/c与mGluRs的结合延缓IP3R分子的激活，减少细胞内Ca2+的释放[10]。

本实验发现DAI后Homer1a在大鼠皮层30 min开始出现表达，至24 h达到高峰，72 h仍有表达。在脑干组织10 min即出现表达，12 h达到高峰，72 h仍有表达。Homer1a在大鼠皮层组织表达较脑干出现稍晚，且在各时间点较脑干表达低。DAI损伤范围的分布与物种间颅脑解剖结构不同有关，灵长类动物有坚硬的大脑镰，因而头颅加速减速运动时镰下胼胝体极易受到损伤[3]。Ross等[11]采用幼猪DAI模型轴索损伤主要发生在脑白质浅层，Povlishock[12]发现小动物轴索损伤好发于脑干。本实验采用Xiao-Sheng等[6]报道大鼠脑弥漫性轴索损伤致伤装置，大鼠头颅于3 ms内在冠状面旋转90°，脑部角速度＞767 rad/s，角加速度＞1.87×103rad/s2，大鼠DAI损伤在病理上集中在脑干内。损伤后在脑干可发现大量轴索肿胀和轴索球。在伤后6～72 h观察发现，同一时间点轴缩球密度在延髓、中脑、胼胝体呈递减趋势[13-14]。Homer1a蛋白在大鼠皮层和脑干的表达变化也说明了DAI损伤较早和主要发生在大脑中线位置。

据报道头颅瞬间旋转可致神经轴索损伤，引起脑干水肿，而轴索内Ca2+超载是轴索损伤的重要中介因素[15]。经过Ca2+细胞化学电镜观察发现DAI后轴浆内细胞器周边聚集、肿胀、在分离的髓鞘板层上钙颗粒沉积、钙分布越多处髓鞘破坏越重、轴浆内也见钙颗粒。虽然以往报道Homer1a可以阻断Homer1b/c与mGluRs的结合延缓IP5R分子的激活减少细胞内Ca2+的释放，但是在DAI的自然病程中作为即早基因表达产物的Homer1a不足以阻断Ca2+通道的开放，减轻神经损伤。增加体内Homer1a 与mGluRs结合延缓IP3R分子的激活，减少细胞内Ca2+的释放，为减轻神经轴索损伤脑干水肿提供新的治疗方案。

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Expression and significance of Homer1a after brain diffuse axonal injury in rat pallium andbrainstem

Liu Wei,Zhang Lei,Guo Qingdong,He Yalong,Fei Zhou.Institute of Neurosurgery,Xijing Hospital,Fourth Military Medical University,Xi’an 710032,China

Fei Zhou,Email:feizhou123@163.com

ObjectiveTo study the expression of Homer1a in brain diffuse axonal injury in rat pallium and brainstem.MethodsNinety SD rats,with weight of(200±20)g,were randomized to normal and DAI group.The rat DAI models were produced in DAI group and the normal group was treated in the same way given to the DAI group except for“free rotating”attack.The rats’pallium and brainsteam were detected for Homer1a by immunoblotting and immunohistochemistry after injury at 10 min,30 min,1 h,6 h,12 h,24 h,48 h,72 h respectively.ResultsThe Homer1a was positive in the pallium after injury from 30 min to 72 h.The Homer1a was positive in the brainstem after injury from 10 min to 72 h.The expression of Homer1a in pallium was weaker than in brainstem at every time we detected.Homer1a was no expression in normal group.ConclusionThe expression of Homer1a in pallium and in brainsteam was significant difference,indicates that the pathognomonic of DAI was brain stem inury.The Homer1a maybe involved in the brain protection after neuronal injury.

Homer protein;Immunohistochemistry; Immunoblotting;Diffuse axonal injury

2015-06-11)

(本文编辑:杨艺)

10.3877/cma.j.issn.2095-9141.2015.06.007

710032西安，第四军医大学西京医院神经外科

费舟，Email：feizhou123@163.com

刘伟,张磊,郭庆东,等.大鼠弥漫性轴索损伤后皮层和脑干Homer1a蛋白的变化及意义[J/CD].中华神经创伤外科电子杂志, 2015,1(6)：343-345.