隐匿性乙肝病毒血液核酸筛查及血清学特性分析

樊璐

(江西省血液中心，江西 南昌330052)

我国是乙型肝炎高发区，流行病学调查显示人群中乙肝表面抗原(HBsAg)携带率为7.18%[1]，其中江西地区13.12%[2]。乙型肝炎病毒(HBV)是重要的输血传播病原体之一，对输血安全构成威胁，主要表现在窗口期感染和隐匿性乙型肝炎病毒感染(occult hepatitis B virus infection，OBI)。 在排除窗口期感染情况下，个体在肝脏或血液中存在HBV DNA，常规血清学方法检测为HBsAg阴性，而在核酸水平检测HBV DNA阳性的感染称为OBI[3]。目前我国采供血系统采用酶联免疫方法(EIA)对HBV感染后的血清学标志物HBsAg进行输血前筛查，随着酶联免疫检测(ELISA)试剂质量的不断提升，输血传播HBV的风险已大大降低[4]。因HBsAg检测存在窗口期问题、HBV感染的非典型血清转阳情况以及病毒变异等引起的隐匿性感染，仅通过检测HBsAg筛查HBV仍存在一定比例漏检[5,6]。核酸扩增检测(nucleic acid amplification test，NAT)是通过扩增检测病原体核酸的一系列技术的总称，与血清学检测技术相比，NAT能缩短HBsAg血清转换前检测的窗口期及提高OBI检出[7,8]，有效加强血液安全。国家卫计委从2010年开始在国内部分省市血液中心开展NAT试点工作，在降低血液病毒窗口期、OBI等输血残余风险[9]方面取得显著成绩。我中心作为试点单位之一，将ELISA与NAT作为重要的互补手段应用于献血者常规筛查，并对部分HBsAg-/HBV DNA+血液进行HBV血清标志物(HBV-M)检测分析，评估南昌地区献血者OBI传播风险，为完善采供血系统HBV血液筛查模式提供依据。

1 材料与方法

1.1 标本来源 本中心2010年8月至2014年12月经健康征询及快速HBsAg金标试纸筛查合格的无偿献血者共计297146人次，其中男性183958人次，女性113188人次，年龄18～55周岁，均符合国家《献血者健康检查要求》。使用EDTA-K2抗凝负压真空管留取献血者等量静脉血2管(无分离胶的用于EIA检测，有分离胶的用于NAT检测)，各5ml，标本离心和保存均按相应的检测试剂说明书要求操作。

1.2 仪器 STAR全自动加样仪(瑞士HAMILTON公司)；FAME全自动酶免分析仪 (瑞士HAMILTON公司)；罗氏Cobas S201核酸检测系统：Microlab STAR IVD混样仪 (瑞士 HAMILTON公司)；Cobas AmpliPrep核酸提取仪(美国Roche公司)；Cobas TaqMan扩增仪(美国Roche公司)；Cobas e411电化学发光系统(美国Roche公司)。仪器均每年定期校验。

1.3 试剂 HBsAg初筛金标试剂：厦门英科新创；HBsAg ELISA试剂：厦门英科新创(初检)、北京金豪 (复检)；HBV/HCV/HIV核酸联检试剂：美国Roche公司Cobas Taqscreen MPX Test1.0(定性检测)；HBV-M试剂：美国Roche公司Cobas e411系统配套试剂(电化学发光法测定)。试剂均批批检合格并在有效期内使用。

1.4 检测方法

1.4.1 HBsAg检测 (1)献血前检查：无偿献血者指端末梢静脉血标本经HBsAg胶体金法试纸初筛为阴性；(2)血液筛查：采用ELISA法对献血者血液标本进行HBsAg双试剂初复检，每种试剂均严格依据试剂说明书设定临界值(Cutoff值)及灰区，OD<(80%×Cutoff)判定为无反应性，OD≥(80%×Cutoff)判为有反应性。初检及复检均为无反应性，标本检测结果判为阴性；初次反应性标本按本中心标准操作规程(SOP)进行双孔重复检测，两孔均为无反应性时判为阴性，一孔或两孔呈反应性时判为阳性。

1.4.2 HBV DNA检测 采用核酸检测(NAT)方法对ELISA检测HBsAg阴性的血液标本进行6混样模式HBV/HCV/HIV联合核酸定性检测，对检测有反应性的混合标本进行拆分。单人份标本检测阳性判定为NAT阳性，单人份标本检测阴性判定为NAT阴性。

1.4.3 NAT阳性标本的确证 将拆分单人份检测为NAT阳性的标本送国家卫计委临检中心，使用罗氏病毒载量检测系统进行HBV DNA鉴别确证试验(荧光定量PCR法)。

1.4.4 HBV-M检测 将HBV DNA鉴别确证试验阳性血液标本采用化学发光法进行HBV血清标志物检测。所有检测均严格按照试剂说明书操作。

1.5 数据收集及统计学分析 采用Microsoft Excel软件对ELISA检测HBsAg阳性和NAT检测HBV DNA阳性标本的结果进行汇总和分类统计；对HBV-M检测结果进行各种模式构成比的比较。使用SPSS21.0统计软件进行χ2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

对297146份经HBsAg快速金标法筛查合格的献血者血液标本进行常规血清学双试剂酶免检测，ELISA法共检出HBsAg阳性标本4965例，阳性率为1.67%，结果见表1；对292181份HBsAg筛查阴性标本进行HBV/HCV/HIV联合核酸检测，共检出NAT阳性标本531例，其中最终经鉴别确证为HBV DNA阳性的标本311例，阳性率为0.11%，结果见表 2；对 311例HBsAg-/HBV DNA+献血者标本采用化学发光法进行HBV血清标志物检测，共有10种模式，各种模式阳性率详见表3；对其中5名献血者进行献血后随访，有1名献血者HBeAb由阴性转化为阳性，其余HBV血清学模式无改变，结果见表4。

表1 HBsAg ELISA检测结果[n(%)]

表2 HBV DNA检测结果[n(%)]

表3 HBsAg-/HBV DNA+献血者HBV血清标志物模式

表4 5名HBsAg-/HBV DNA+献血者随访检测结果

3 讨论

HBV感染是危害人类健康最严重的问题之一，全球约有3.5亿人是HBV慢性感染携带者[10]，中国有超过9300万人感染或携带HBV。HBV可经输血传播，并且与病毒本身、检测手段等因素关系密切。输血引起的病毒感染主要是HBV感染[11]，有研究表明，HBV血清转换前窗口期与隐匿性感染献血者是导致HBsAg筛查后经输血传播HBV残余风险的主要原因[12]。HBV感染后最早存在于血清中是HBV DNA，实行HBV DNA检测可以明显缩短窗口期，筛查出隐匿性感染或HBV慢性携带者[13]。 据 Satake M 等人报道[14]，2%～18%的 HB-sAg阴性患者经输注HBV DNA阳性血液后导致HBV感染，并且隐匿性感染者(HBcAb阳性)供血引起的输血后感染风险是窗口期供血的10倍以上，因此OBI更应引起高度重视。

HBsAg检测灵敏度受病毒基因型、变异情况、献血者体内是否存在HBsAb以及是否联合其它疾病感染等多重因素影响[15]。目前的HBsAg诊断试剂对于不同突变的HBsAg检测能力不同，甚至发生漏检，导致出现HBsAg-/HBV DNA+的情况。HBV核酸筛查的开展为隐匿性HBV的检测提供了基础。OBI流行于世界各地区，其感染率与HBV流行率呈正相关[16]。我国无偿献血者中的OBI流行率为1:570-1:7517[17-19]。目前国内数家血液中心已对无偿献血人群血液标本进行EIA/NAT检测，筛选OBI确诊标本，其中深圳地区OBI流行率约为0.33%[20]，唐山地区约为0.29%[21]，江苏地区约为0.80%[22]，大连地区约为0.43%[23]，我中心刘强等人经研究发现南昌地区约为1.38%[24]。各地区感染率的差异可能与各地献血人群构成不同及HBV感染情况不一相关。

随着核酸检测不断深入开展，发现采用常规酶免方法进行血液筛查，输血传播HBV的残余风险明显高于HCV和HIV。本中心于2010年起在原有EIA检测基础上增加NAT，运用罗氏Cobas S201平台对ELISA阴性血液标本进行6人份混样NAT，筛查 HBV DNA，HCV RNA 及 HIV RNA。 随着高灵敏度的自动化核酸检测系统应用于血液筛查，HBV核酸检出能力有了大幅度提高。自2010年8月至2014年12月对292181份HBsAg筛查阴性献血者血液标本进行NAT检测，检出311例HBsAg-/HBV DNA+样本，阳性率为0.11%，此数据充分表明本地区HBsAg阴性献血者血液仍有一定的经输血传播HBV残留风险。研究结果显示，血液病毒核酸检测能有效筛检出HBsAg为无反应性的HBV感染标本，对于避免OBI或HBV窗口期等输血残余风险至关重要，是保障血液安全的一项有效措施。本研究中HBsAg阴性样本HBV DNA阳性率高于国外HBV低流行率国家的检出率，也高于国内一些省份的检出率[25]，其主要原因可能是江西地区为HBV高流行区所致。本研究发现男性献血者中HBsAg阳性率、HBV DNA阳性率均高于女性，这可能与南昌地区普通人群中HBV的流行特征有关。18~25岁献血者中的HBV检测阳性率明显低于25~55岁献血者，我国于1991年开始普及新生儿接种乙肝疫苗，18~25岁年龄组处于疫苗保护作用中，故HBV阳性率最低，验证了年龄与阳性率的关系。初次献血人群中HBsAg及HBV DNA阳性率均显著高于重复献血人群，表明初次献血者HBV感染率高于重复献血者。

HBV血清学特征复杂多变，感染者会在不同时期出现不同的血清标志物。WHO推荐的HBV筛查策略为：HBsAg、HBcAb(适合情况下)和病毒核酸检测HBV DNA[26]。HBV窗口期与隐匿性感染献血者均为血清HBsAg阴性而HBV DNA阳性；窗口期献血者HBsAg会随时间推移由阴转阳，而OBI献血者其HBsAg一般不会阳转，并通常伴随HBcAb阳性，有时在低滴度HBsAb献血者中也存在[27,28]。由于HBsAg阴性、HBcAb阳性人群如OBI个体捐献的血液有输血传播HBV的可能性，一些发达国家开展了HBV感染后的另一重要血清学标志物核心抗体(HBcAb)筛查。由于HBcAb筛查容易导致血源浪费，仅适合乙肝低流行率区域[12]。在乙肝高发地区，因其抗-HBc阳性率较高，在献血者中不能普遍开展该项目检测，则开展NAT以进一步降低输血传播HBV风险十分必要。本研究发现的311例HBsAg-/HBV DNA+标本经乙肝补充血清学试验，表现为10种血清学模式，其中HBVM全部阴性占9.65%，疑似窗口期感染；HBsAg阳性占23.15%，表明ELISA试剂灵敏度有待提高；HBcAb阳 性 占 87.78%，HBcAb、HBeAb 阳 性 占55.62%，HBsAb、HBcAb 阳 性 占 24.76% ，HBsAb、HBeAb、HBcAb阳 性 占 10.61%。 HBsAg-/HBV DNA+献血者中HBcAb阳性比例最大，这符合OBI的表现形式[29],表明本地区OBI献血者的血清学特征以HBcAb阳性为主。HBcAb阳性时可能处于乙肝慢性感染期或恢复期，因HBV复制水平低，HB-sAg浓度未达到试剂敏感度，低于最低检测限，多数为隐匿感染所致。此现象的发生也可能是高浓度HBsAg导致后带现象，出现假低值，严重时可以造成假阴性[30]。对5位HBsAg-/HBV DNA+献血者进行随访，结果一直为HBsAg阴性、HBcAb阳性，表明隐匿性HBV感染可能性较高。

近年来在国家卫计委的推动下，血液筛查策略由 2遍ELISA检测向 1遍 ELISA检测、1遍NAT检测过渡，可尽量减少隐匿性HBV感染等因素引发的输血安全问题，对于保障血液质量具有重要意义。针对隐匿性HBV感染的特点，采供血系统应选用灵敏度和特异性较高的酶免检测试剂，适当联合使用国外优质试剂，并进一步开展HBV核酸定性及定量检测，普及白细胞过滤及病毒灭活等减少血液制品输血相关病毒感染的处理方法。在HBV高流行区，要高度关注献血者HBV血清标志物，条件允许的情况下，尽可能增加筛查指标。核酸检测技术的应用是采供血系统血液检测实验室预防漏检的主要途径，防控HBV感染捐献者尤其是隐匿性或窗口期感染者是降低输血风险的根本。

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