山茱萸对大鼠糖尿病肾病的作用

李晨

(山东大学齐鲁医院(青岛)内分泌科，山东 青岛 266000)



山茱萸对大鼠糖尿病肾病的作用

李晨

(山东大学齐鲁医院(青岛)内分泌科，山东 青岛 266000)

目的 探讨山茱萸对糖尿病大鼠糖尿病肾病的影响及机制。方法 采用腹腔注射链脲佐菌素方法构建糖尿病模型，将Sprague-Dawley大鼠随机分为正常对照组、糖尿病组、山茱萸小剂量(400 mg·kg-1·d-1)干预组及山茱萸大剂量(800 mg·kg-1·d-1)干预组和氟伐他汀阳性对照组，每组10只。造模20周后检测各组大鼠肾脏体质量比(K/B)，血浆肌酐、尿素氮和尿酸的含量，肾小管间质谷胱甘肽(GSH)、活性氧(ROS)含量，肾组织骨形态发生蛋白-7(BMP-7)、Smad3、Smad5、Smad7、转化生长因子-β(TGF-β)、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)、核转录因子(NF-κB) mRNA表达。结果 与正常对照组比较，糖尿病组大鼠肾脏K/B增高，血浆肌酐、尿素氮和尿酸的含量增高，肾组织BMP-7、Smad3、Smad5、Smad7、TGF-β、ROS、MCP-1和NF-κB表达上调，GSH表达下调，差异均有显著性(F=8.16～127.30，P<0.05)。与糖尿病组比较，小剂量和大剂量山茱萸干预组大鼠肾脏K/B、血浆肌酐、尿素氮和尿酸含量下降，BMP-7、Smad3、Smad5、Smad7、TGF-β、ROS、MCP-1和NF-κB表达下降，GSH表达增加，差异均有显著性(q=2.842～243.400，P<0.05)。结论 山茱萸可抑制糖尿病大鼠肾小管间质损伤，降低氧化应激可能是其作用机制。

山茱萸；糖尿病肾病；氧化性应激

糖尿病是一种以血糖升高为特征的代谢性疾病，长期血糖升高可累及其他脏器的微管系统，包括眼、肾脏和神经[1]。糖尿病肾病是糖尿病病人的常见并发症，主要症状包括持续性大量清蛋白尿、肾病综合征、肾小球滤过率(GFR)下降，并最终导致肾衰竭。降低血糖，控制和治疗并发症是治疗糖尿病的主要目标[2-3]。临床研究结果显示，山茱萸可显著降低糖尿病病人血糖水平，同时在改善病人临床症状，减缓肾衰竭和降低尿蛋白方面具有显著效果[4-5]。NADPH氧化酶是糖尿病肾病发生的危险因素之一，其导致的氧化应激可影响肾脏细胞、细胞外基质及肾脏血管通透性，与糖尿病肾病密切相关[6]。本文观察山茱萸通过下调糖尿病大鼠体内氧化应激水平，对糖尿病大鼠肾脏纤维化水平的作用。

1 材料与方法

1.1实验材料

雄性Sprague-Dawley大鼠，体质量为(200±10)g，购自上海斯莱克实验动物有限公司；链脲佐菌素、双氢罗丹明-123，均购自美国Sigma公司；氟伐他汀购自诺华制药有限公司；谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)和超氧化物歧化酶(SOD)活力检测试剂盒、谷胱甘肽(GSH)含量检测试剂盒，均购自碧云天生物技术有限公司；核蛋白提取试剂盒购自美国Pierce公司；血浆肌酐、尿素氮和尿酸检测试剂盒均购自美国Siemens公司；RNA逆转录试剂盒购自日本KaTaRa公司。

1.2糖尿病动物模型构建

雄性Sprague-Dawley大鼠50只，随机分为正常对照组(N组)、糖尿病组(D组)、山茱萸低剂量组(FC-L组)、山茱萸高剂量组(FC-H组)及氟伐他汀组(Flu组)，每组10只。大鼠腹腔按55 mg/kg剂量注射链脲佐菌素构建糖尿病大鼠模型，FC-L组大鼠按400 mg/(kg·d)灌胃给山茱萸，FC-H组大鼠按800 mg/(kg·d)灌胃给山茱萸，Flu组作为阳性对照组按20 mg/(kg·d)灌胃给Flu组，N组和D组给予等体积生理盐水，共喂养12周。

1.3检测指标及方法

1.3.1大鼠肾脏体质量比(K/B) 大鼠处死后，称量大鼠体质量(BW)，剪取左肾，称取其质量(KW)，计算K/B。K/B=KW×2/BW。

1.3.2肌酐、尿素氮和尿酸含量 断头处死大鼠，用抗凝管收集血液，颠倒混匀，4 ℃ 下以3 000 r/min离心10 min，取血浆，按照试剂盒说明书测定肌酐、尿素氮和尿酸含量。

1.3.3肾脏组织中活性氧(ROS)和GSH的表达①将大鼠肾脏组织剪碎，筛网过滤，收集游离细胞，加入1 μmol/L双氢罗丹明-123，在37 ℃、体积分数0.05的CO2条件下孵育2 h，通过流式细胞仪检测488 nm激发波长下ROS表达。②肾脏细胞经液氮和37 ℃水浴快速冻融2次，离心，取上清按照试剂盒说明书测定GSH含量。

1.3.4大鼠肾脏组织中NF-κB、BMP-7、Smad3、Smad5、Smad7、TGF-β和MCP-1的mRNA水平将大鼠肾脏组织经TRIZOL法提取总RNA，按以下序列进行扩增。NF-κB上游引物：5′-GAAGAAG-CGAGACCTGGAG-3′，下游引物：5′-TCCGGAAC-ACAATGGCCAC-3′；BMP-7上游引物：5′-TCCGA-TTCCCTGCCCAAGTG-3′，下游引物：5′-AGGCCG-TCTTCAGTACCCAGG-3′；Smad3上游引物：5′-G-CAGAACGTCAACACCAAGTGC-3′，下游引物：5′-GTGCAGGTCTGGCCATCGC-3′；Smad5上游引物：5′-AATGAATTGTATCCTGCCGGTA-3′，下游引物：5′-TAAACAATCGTGTTGGGGAAGC-3′；Smad7上游引物：5′-CCATCACCTTAGCCGACTCT-3′，下游引物：5′-GCAAAAGCCATTCCCCTGAG-3′；TGF-β上游引物：5′-CCCAGCATCTGCAAAGCTC-3′，下游引物：5′-GTCAATGTACAGCTGCCGCA-3′；MCP-1上游引物：5′-TTGACCCGTAAATCTGAA-GCTAAT-3′，下游引物：5′-TCACAGTCCGAGTC-ACACTAGTTCAC-3′；GAPDH上游引物：5′-ACCACAGTCCATGCCATCTA-3′，下游引物：5′-TCCACCACCCTGTTGCTGAC-3′。检测各组大鼠肾脏组织中NF-κB、BMP-7、Smad3、Smad5、Smad7、TGF-β和MCP-1的mRNA水平。

1.4统计学处理

应用SPSS 10.0软件进行统计学处理，数据间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)。

2 结 果

2.1各组大鼠K/B比较

D组大鼠的K/B与N组比较明显增高，FC-H组、Flu大鼠的K/B均较D组显著下降，差异有显著性(F=8.16，P<0.05)。见表1。

2.2各组大鼠血浆中肌酐、尿素氮和尿酸含量比较

D组大鼠的肌酐、尿素氮和尿酸含量与N组比较明显增高，差异有显著意义(F=80.36～109.70,P<0.05)；山茱萸及Flu干预后，大鼠的肌酐、尿素氮和尿酸含量均显著下降,与FC-L组比较，FC-H组的下降更显著,差异均有统计学意义(q=2.842～27.210,P<0.05)。见表1。

2.3各组大鼠肾脏组织中ROS、GSH表达比较

D组大鼠的ROS表达与N组比较明显增高，GSH表达降低，差异有显著意义(F=95.78、22.88,P<0.05)；山茱萸及Flu干预后，ROS表达显著下降,GSH表达升高，与FC-L组比较，FC-H组变化更显著(q=2.148～23.420,P<0.05)。见表2。

2.4各组大鼠肾脏组织中BMP-7、Smad3、Smad5、Smad7、TGF-β、MCP-1和NF-κB mRNA表达比较

D组大鼠的BMP-7、Smad3、Smad5、Smad7、TGF-β、MCP-1和NF-κB mRNA表达与N组比较均明显增高，差异有显著意义(F=42.45～127.30，P<0.05);山茱萸及Flu干预后，大鼠以上各指标均显著下降，与FC-L组比较，FC-H组下降更显著(q=3.748～243.400,P<0.05)。见表3。

3 讨 论

糖尿病是一种以血糖升高为特征的慢性代谢性疾病，糖尿病肾病是常见并发症之一，可导致病人肾衰竭。研究表明，高糖血症和高脂血症可引起氧化应激，ROS及其引发的氧化应激反应可以触发Smad/TGF-β和NF-κB/AKT信号通路，上调BMP-7和MCP-1，从而引起肾脏的炎症损伤和纤维化，导致血管和微管系统细胞损伤，进而引起肾脏功能的不可逆损伤[7-12]。

表1 各组大鼠K/B及血浆肌酐、尿素氮和尿酸相对含量

表2 各组大鼠肾脏组织ROS及GSH表达

表3 各组BMP-7、Smad3、Smad5、Smad7、TGF-β、MCP-1和NF-κB mRNA表达

山茱萸味酸、涩，微温，归肝、肾经，能补益肝肾，滋阴补气。大部分糖尿病病人属于气阴两虚型病症，所以山茱萸可用于治疗糖尿病。临床研究显示，山茱萸可有效改善胰岛素抵抗，降低血糖，改善糖尿病肾病的症状，是一种可有效治疗糖尿病的天然产物[13-14]。血肌酐、尿素氮和尿酸分别为含氮的有机物、蛋白质代谢和嘌呤代谢的终末产物。在肾功能正常的情况下，其可从肾小球滤出，当糖尿病损伤肾脏使肾小球滤过率下降时，血肌酐、尿素氮和尿酸迅速升高，表示肾功能已严重损害。Flu作为广泛使用的降脂药物，在多个研究中被作为阳性对照，因此本文将Flu组作为阳性对照观察山茱萸对大鼠糖尿病肾病的治疗作用。

本文研究结果显示，糖尿病模型组大鼠的K/B、血肌酐、尿素氮和尿酸含量以及ROS表达与N组比较明显增高，GSH表达降低，差异有显著性；与D组比较，山茱萸及Flu干预后，大鼠的K/B、血肌酐、尿素氮和尿酸含量以及ROS表达均显著下降，而GSH表达增高；且与FC-L组比较，FC-H组的变化更显著，差异有显著性。提示山茱萸可能通过降低氧化应激反应发挥生物学作用。

本文结果还显示，糖尿病模型组大鼠的BMP-7、Smad3、Smad5、Smad7、TGF-β mRNA与N组比较明显增高。与D组比较，山茱萸及Flu干预后，以上各指标均显著下降；且与FC-L组比较，FC-H组的下降更显著，提示山茱萸可通过调节BMP-7、Smad3、Smad5、Smad7、TGF-β、MCP-1和NF-κB表达，逆转肾脏的炎症和纤维化。因此，推测山茱萸抑制肾脏损伤与间质纤维化的机制是抑制BMP-7、Smad3、Smad5、Smad7、TGF-β信号通路及其下游蛋白的表达。

综上所述，山茱萸可有效治疗大鼠糖尿病肾病，为临床应用提供实验基础。

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(本文编辑 黄建乡)

EFFECT OF FRUCTUS CORNI ON DIABETIC NEPHROPATHY IN RATS

LIChen

(Department of Endocrinology, Qilu Hospital of Shandong University, Qingdao 266000, China)

ObjectiveTo investigate the effect of Fructus Corni on diabetic nephropathy in rats and its mechanism.MethodsA diabetic model of rats was created using intraperitoneal injection of Streptozotocin, and 40Sprague-Dawleyrats were randomized to four equal groups: normal control group, diabetes group, low-dose Fructus Corni group (400 mg·kg-1·d-1), and high-dose Fructus Corni group (800 mg·kg-1·d-1). Twenty weeks after modelling, the following items were detected in rats of each group: kidney to body weight ratio (K/B), plasma creatinine, urea nitrogen and uric acid; the levels of glutathione (GSH) and reactive oxygen species (ROS) in rat kidney cells; the expressions of bone morphogenetic protein-7 (BMP-7), Smad3, Smad5, Smad7, transforming growth factor-β (TGF-β), Monocyte Chemotactic Protein-1 (MCP-1) and nuclear transcription factor-κB (NF-κB).ResultsCompared with the normal group, rats in the diabetes group showed significant increase in K/B, plasma levels of ROS, creatinine, urea nitrogen and uric acid, up-regulation of expressions of BMP-7, Smad3, Smad5, Smad7, TGF-β, ROS, MCP-1 and NF-κB in renal tissue, and down expression of GSH (F=8.16-127.30,P<0.05). Compared with the diabetes group, rats in the low-dose and high-dose Fructus Corni groups, K/B, plasma levels of creatinine, urea nitrogen and uric acid, and the expressions of BMP-7, Smad3, Smad5, Smad7, TGF-β, ROS, MCP-1 and NF-κB declined, and the expression of GSH up-regulated (q=2.842-243.400,P<0.05).ConclusionFructus Corni can relieve damage of renal tubular interstitial in diabetic rats, reducing oxidative stress may be its mechanism of action.

fructus corni; diabetic nephropathies; oxidative stress

2015-03-27;

2015-07-26

李晨(1978-)，女，硕士，主治医师。

R587.24

A

1008-0341(2015)06-0674-04