DNA变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的实验教学改进

鲍思元

(湖北科技学院 基础医学院, 湖北 咸宁 437100)

DNA变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的实验教学改进

鲍思元

(湖北科技学院 基础医学院, 湖北 咸宁 437100)

DNA变性聚丙烯酰胺凝胶电泳在现代生物技术中的地位十分重要，但在实验中，聚丙烯酰胺凝胶电泳的操作难度比较大，影响因素比较多，耗时比较长。为了使DNA变性聚丙烯酰胺凝胶电泳适合于实验教学，对聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳技术相关操作流程进行了研究和探索，对实验进行了改进和优化。改进和优化后的实验操作简易、详细，试剂配方更合理，成功率得到提高，学生能在4学时内完成，为进行实验教学提供了基本条件。

聚丙烯酰胺凝胶；电泳；改进；优化；实验教学

DNA聚丙烯酰胺凝胶电泳是一种比较普遍的电泳技术，采用聚丙烯酰胺作为电泳介质，是聚合酶链反应、单链构象多态(PCR-SSCP)分析中不可缺少的技术，多用于单链碱基易位、插入或缺失等基因变异情况的筛查，还可以广泛用于遗传育种、基因定位、种子活力测定等方面【1】。

与琼脂糖凝胶电泳相比，聚丙烯酰胺凝胶电泳操作复杂，价格高，但其分辨率高，能分辨相差几个碱基的核酸小片段，结果可永久保存。从该胶中回收的DNA纯度极高，可适用于分子生物学中较高要求的实验【2-3】。但是，在实验过程中，常会出现一些问题，如胶破裂、背景太深、无DNA带或带纹不清晰、影响实验结果的因素等。为了使DNA变性聚丙烯酰胺凝胶电泳在实验教学中能顺利进行，我们对聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳技术相关操作流程进行了研究和探索，简化了实验操作步骤，优化了操作流程，使优化后的DNA变性聚丙烯酰胺凝胶电泳技术更适合于实验教学。

1 实验原理

聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺(Acr)单体和少量交联剂甲叉双丙烯酰胺(Bis)在化学催化剂过硫酸铵(AP)和加速剂四甲基乙二胺(TEMED)的作用下形成的三维空间的高聚物。聚合后的聚丙烯酰胺凝胶形成网状结构，具有分子筛效应。凝胶孔径的大小可通过控制单体和交联剂的比例来调节，从而满足不同分子量物质的分离要求，如表1所示[4]。聚丙烯酰胺凝胶包括非变性聚丙稀酰胺凝胶和变性聚丙烯酰胺凝胶，前者用于分离和纯化双链DNA片段，后者用于分离和纯化单链DNA片段。

2 实验试剂及配制

表1 DNA在聚丙烯酰胺凝胶中的有效分离范围

注：1)N，N′-亚甲双丙烯酰胺的浓度为丙烯酰胺的1/30。；2)列出的数字是迁移率与染料相同的双链DNA的粗略大小(核苷酸对)。

2)变性剂。1 M NaOH 1 mL，甲酰胺95 mL，溴酚蓝0.05 g，二甲苯青0.05 g，加双蒸水定容至100 mL。

3)固定液。100 mL冰醋酸溶于双蒸水定容至1 000 mL。

3 DNA变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的操作流程

3)电泳。安装电泳装置，在电泳槽中加入1×TBE缓冲液，使缓冲液覆盖样品孔。拔出样品梳，用移液器吸取适量缓冲液冲洗样品孔。打开变压器，恒定功率60 W预电泳15～30 min。预电泳结束后，用移液器将DNA样品小心注入样品孔中(加样量为3～5 μL)，电泳直至带型分开。

4)固定。关闭电源，卸下玻璃板，剥离玻璃板，将胶板置于固定液中固定30 min, 直到指示剂颜色褪去。

5)漂洗。将胶板转移到双蒸水中漂洗三遍，每次2～3 min。

6)染色。转移胶板至染色液中，在摇床上摇动染色30～40 min。

7)显影。将胶板在双蒸水中漂洗5～10 s后立即放入预冷为4 ℃～10 ℃的显影液中，摇动显影直到带型完全出现。

8)定影。将出现带型的胶板放入固定液中定影2～3 min，再用双蒸水漂洗两次(每次2 min)。

9)干胶。胶板置于室温自然干燥。

10)带型统计。

4 实验操作的注意事项

1)准备玻板时，反硅化剂一定要涂匀，否则揭胶时会撕破胶块。

2)配好的丙烯酰胺单体凝胶贮存液用棕色瓶盛装，置冰箱内保存(可放1～2个月)；如有不溶物应过滤。

4)制胶时对过硫酸铵的量要适当把握，防止出现胶不凝固或凝固过快而来不及灌胶的现象。

5)胶制备完成后立即灌胶。因为加入TEMED和过硫酸铵后，胶即刻反应，若不及时灌胶则会导致凝胶凝固不均匀，电泳后得到的条带形状不规则。灌胶完毕后要立即插入样品梳，否则凝胶凝固再插样品梳则会毁胶。拔样品梳时应垂直向上，均匀用力，缓慢拔出，否则会导致样品槽损毁。总之，若凝胶制备出现问题则直接导致电泳条带不清晰、变形、拖尾等，直接影响实验结果。

6)制凝胶时，应避免产生气泡。因为气泡会影响电泳分离效果。

7)丙烯酰胺和双丙烯酰胺具有很强的神经毒性并容易吸附于皮肤，操作时应避免沾在脸、手等皮肤上，最好戴一次性塑料手套操作。凝胶倒完以后剩余的胶液一定要等待其凝固后，才能挑出来丢弃，避免对环境造成污染。因为凝胶充分交联以后没有毒性。

8)显影时在水里漂洗时间为5～10 s，时间过长会使带型的信号微弱。显影液温度不要过高，否则会使背景变深。

5 实验操作的调控与优化

5.1 渗样的问题

在点样时，常常出现一个点样孔的样品渗透到邻近的点样孔里，这样跑出的带型就不能正确反应该点样孔里的信息，造成实验的失败。文中从三个方面探讨如何避免渗样的问题：(1)在制胶时，插完样品梳后，用夹子夹住常出现渗样的一端，减少玻板之间的距离；(2)在点样时，用小夹子夹住常出现渗样的一端，使梳子与玻板贴近；(3)当点的样品较多而点样速度又慢时，可以分段点样，即点完若干样品后，让其先跑5～10 min，再点另一段样。

5.2 电泳时间

在跑胶时，电泳时间至关重要。比如,在做水稻SSR分析时，有些SSR等位基因之间的差别较大，只要跑1 h的时间就足以看出多态性。电泳时间长了，带型反而变弱，影响读胶。而有些SSR等位基因之间的差别较小，电泳时间短了，带没有跑出来，就需要增长电泳时间，直到样品的遗传信息充分反应出来。

5.3 点样道数

同一对引物组合在亲本间等位基因差异较小且非特异扩增带较少时，可使用多次点样技术提高实验的成功率，即在同一块胶上点样2～4次，由此可以适当降低成本，提高效率。

6 讨论

聚丙烯酰胺凝胶电泳属于凝胶电泳的一种。聚丙烯酰胺凝胶电泳实用性最强，凝胶机械性能好、有弹性、透明、化学性质相对稳定、对pH和温度变化不敏感、为非离子型、没有吸附和电渗作用等，尤为突出的是实验中所需样品量小(1～100 μg)，而分辨率又高。因此广泛应用于许多学科中，在样品的分离、纯度鉴定、多态性分析、分子量测定中，是一个很有价值、有时甚至是不可缺少的技术。但在实验操作中，聚丙烯酰胺凝胶电泳操作难度比较大，影响因素比较多，经过本研究的改进和优化，实验操作趋于简易、详细，试剂配方更合理，成功率得到提高，学生能在4学时内完成，为进行实验教学提供了基本条件。

聚丙烯酰胺凝胶电泳实验的耗时相当长，在实验教学环节上要灵活安排时间。在实验课前，要求学生对实验指导进行预习，对实验操作的各个步骤要充分熟悉。学生进入实验室后，教师要对实验课的时间进行统筹安排，首先，将实验的操作流程讲解给学生，要注意每一个细节，教师最好要亲手示范关键步骤；然后，学生按照要求进行实验，教师在关键步骤要进行提醒和指导。在耗时较长的电泳过程中，教师再进一步仔细讲解聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理和相关知识，也可以介绍一些科研方面的研究成果，便于学生对知识的理解和掌握，激发学生的学习兴趣。只有这样，才能培养学生的实践能力、科研能力、创新能力。

在现代生物技术中，很多前沿科研都涉及聚丙烯酰胺凝胶电泳，如基因定位、基因克隆、转基因等。我们可以尝试将科研实验和教学实验紧密结合和有机转化，将科研成果快速转化到实验教学中，使学生能及时了解最新的科研动态和研究成果，拓宽学生的专业视野，构建全面、系统、前沿、创新的教学实验平台。

7 结束语

DNA变性聚丙烯酰胺凝胶电泳在分子生物学科研中是一种重要的实验技术，许多前沿科研都涉及聚丙烯酰胺凝胶电泳。但在实验中，聚丙烯酰胺凝胶电泳的操作难度比较大，影响因素比较多，耗时比较长。对于实验操作技能比较弱的大学生来说，很难开展此类实验教学。为了使DNA变性聚丙烯酰胺凝胶电泳适合于实验教学，本研究对DNA变性聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳技术相关操作流程进行了改进和优化，对学生操作注意点和教师讲授注意点作了详细的论述。改进和优化后的实验操作趋于简易、详细，学生能在4学时内完成。学生通过DNA变性聚丙烯酰胺凝胶电泳实验可以接触到科研前沿，可以培养动手能力、分析与解决问题的能力、创新能力。

[1]李其松，王金玉，沈华，等. DNA聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染方法的探讨[J].黑龙江畜牧兽医，2006(10)：79-80.

[2]Promega.Protocols and applications guide[M].3rd.USA:Promega Corporation，1996:156.

[3]李宏业，范树国，刘玉乐，等.改良聚丙烯酰胺凝胶电泳检测DNA[J].细胞生物学杂志，1999，21(4)：201-203.

[4]萨姆布鲁克 J,拉塞尔 D W.分子克隆实验指南[M]．3版．黄培堂，译．北京：科学出版社，2002：419.

Improvement of DNA Denaturing Polyacrylamide Gel Electrophoresis in Experiment Teaching

BAO Siyuan

(College of Basic Medical, Hubei University of Science and Technology, Xianning 437100, China)

Status of DNA denaturing polyacrylamide gel electrophoresis is very important in modern biological technology, but polyacrylamide gel electrophoresis operation is difficult, affected by many factors, time-consuming. In order to make the DNA denaturing polyacrylamide gel electrophoresis adapt to experimental teaching, the vertical polyacrylamide electrophoresis technology related operation process is researched, and the experiment is improved and optimized. The improved and optimized experimental operation tends to be convenient, detailed, high success rate, less time-consuming, and reagent formula is more reasonable, which provide a basic condition for experimental teaching.

polyacrylamide gel; electrophoresis; improvement; optimization;experiment teaching

2014-07-07；修改日期: 2014-03-12

鲍思元(1976-)，男，硕士，讲师，研究方向：植物分子遗传学和生物技术。

G642.0；Q94-33

A

10.3969/j.issn.1672-4550.2015.02.040