气相色谱法测定咖啡因中有机溶剂三氯甲烷的残留量

吴均静 张广涛

摘 要：目的：建立原料药咖啡因中有机溶剂三氯甲烷残留量的测定方法。方法：采用顶空气相色谱法，电子捕获器，以超纯水为溶剂，色谱柱为石英毛细管色谱柱：PE ELITE-5MS（30m×0.25mm，膜厚0.25μm），载气为N2。结果：三氯甲烷测定方法的线性关系，重复性，检测限，定量限均达到了预定的分析要求，回收率在95.7%-98.6%之间。结论：本方法能快速准确的检测出有机溶剂三氯甲烷的残留量，能用于原料药咖啡因中残留溶剂的检测。

关键词：残留溶剂1；三氯甲烷2；顶空气相色谱法3；咖啡因4

咖啡因是一种黄嘌呤生物碱化合物，是一种中枢神经兴奋剂，能够暂时的驱走睡意并恢复精力。有咖啡因成分的咖啡、茶、软饮料及能量饮料十分畅销，因此，咖啡因也是世界上最普遍被使用的精神药品。在咖啡因合成过程中，粗品咖啡因结晶离心后母液中含有0.5%-1.5%的咖啡因，生产中使用三氯甲烷萃取，回收母液中的咖啡因。在人用药品注册技术要求国际协调会（ICH），美国药典（USP）和中国药典中都划定三氯甲烷为第二类溶剂，有麻醉性和致癌可能性，并规定其限度0.006%。由于本试验只检查一种残留溶剂，故采用毛细管柱顶空进样等，方法，测定方法简便，准确，重复性好。

1 仪器设备和试剂

PE-HS16L顶空自动进样器， PE-Clarus 580气相色谱仪；顶空瓶：20ml 顶空瓶（PE公司）。原料药咖啡因样品（公司待销售成品），三氯甲烷为优级纯，试验用水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

（1）色谱柱：PE Elite-5MS，30m×0.25mm×0.25μm，石英毛细管色谱柱。

（2）顶空进样器条件：炉温，70℃；取样针，85℃；传输线，110℃；载气气压力，16.5psi；加压时间，3min；进样时间，0.02min；拔针时间，0.2min；保温时间，20min。

（3）GC条件：汽化室温度，110℃；柱温箱温度，80℃；检测器温度，375℃；载气，N2（纯度为99.999%）；流速，1ml/min；分流，30；补充气体，30ml/min。

2.2 线性关系考察

（1）溶液的制备与测试

线性关系选择期望浓度0.6000ug/ml的50%-120%之间8个点，即0.300ug/ml，0.360ug/ml，0.420ug/ml，0.480ug/ml，0.540ug/ml，0.0

60ug/ml，0.660ug/ml，0.720ug/ml，取优级纯三氯甲烷试剂，分别配制上述浓度溶液。取24个顶空瓶，将上述溶液每瓶各取3个1ml上述分别放入顶空瓶中密封，在70℃保温20分钟，然后进样，每瓶进样1次，以同一浓度溶液的3次进样的峰面积平均值为一点，共8点做标准曲线，可接受标准为：n=8，R2≥0.990，截距≤25%。

（2）标准曲线的绘制

各浓度对应锋面积为：117143，145779，170525，195270，220015，

247250，269505，294251。以三氯甲烷溶液浓度为横坐标，以三氯甲烷峰面积为纵坐标，拟合线性回归方程作图。线性回归方程为：y=419306x-6379.1，R2=0.9995，截距=2.17%，线性关系良好符合要求。

2.3 重复性试验

用优级纯三氯甲烷和超纯水配制6份0.600ug/ml重复性试验溶液，取6个顶空瓶每瓶各加1ml重复性试验溶液密封，每瓶在70℃保温20分钟，然后进样，以6次进样各0.600ug/ml峰面积计算RSD，可接受标准为：n≥6，RSD≤2.5%。测试锋面积结果分别为：179993，183230，179604，181439，179556，179523。通过计算RSD=0.8297%，重复性试验符合规定。

2.4 回收率试验

（1）对照溶液测定：取优级纯三氯甲烷适量加超纯水水配成6.000ug/ml溶液，取10ml至100ml容量瓶中稀至刻度，即三氯甲烷浓度为0.600ug/ml，测定3次，取平均值，峰面积RSD≤2.5%。

（2）分别取样品约0.100g至3个100ml容量瓶中，分成3组，分别加入11ml，10ml，9ml，浓度为6.000ug/ml三氯甲烷溶液，加入超纯水稀释至刻度，配制3个不同三氯甲烷浓度（0.660ug/ml，0.600ug/ml，0.540ug/ml）的样品，各测定3次，即测定9次，计算回收率，回收率应在80%-120%之间，RSD≤10%。

（3）对照溶液RSD=0.6721%，样品溶液RSD=1.6744%，回收率分别为95.7%，98.6%，95.9%。回收率在95.7%-98.6%之间，符合规定。

2.5 检测限（LOD），定量限（LOQ）试验

取6.000ug/ml浓度三氯甲烷溶液，用超纯水在100ml容量瓶依次逐级稀释，按对应的检测方法测定每个浓度测试3次，直至测定的色谱峰峰高为基线噪声的3倍（3次峰面积RSD≤20%）和10倍（3次峰面积RSD≤20%），计算三氯甲烷对应的含量，即分别为检测限和定量限。通过试验得出检测限（LOD）：0.003ug/ml，定量限（LOQ）为0.006ug/ml。

2.6 样品含量测定

（1）样品溶液：分别取5个成品批次咖啡因样品0.1000g至10ml容量瓶中加水溶解，取1ml至顶空瓶中密封，在70℃保温20分钟，然后测试。有三氯甲烷峰出现时用三氯甲烷对照溶液的浓度和峰面积计算样品中三氯甲烷含量。

（2）对照溶液：取分析纯三氯甲烷适量精密称定，用超纯水稀至0.600ug/ml溶液取3个顶空瓶每瓶将上述溶液取1ml到入密封，在70℃保温20分钟，然后进样，每瓶进一次样，以3次进样各峰面积计算RSD，RSD≤2.5%。

（3）三氯甲烷残留量限度为0.006%，通过计算本测试方法三氯甲烷的残留量检测限（LOD）和定量限（LOQ）分别为0.00003%和0.00006%，测试5批咖啡因样品（批号：TC2014901～TC2014905）中有机溶剂残留量，测试结果均小于LOD，符合标准规定，能在市场销售。

3 结束语

（1）由于三氯甲烷易挥发，在溶液配制和测试过程中应控制，确保测试结果的准确性。

（2）测试时应关注标准品溶液的稳定性，建议采取测试样品溶液后继续对标准溶液测试，变化值≤20%为宜。

（3）由于残留溶剂含量测定属限度检查，我们关注的是样品中残留溶剂的含量是否超出限度，因此为方便快捷完成测试，配制标准溶液即可按照残留溶剂限度标准0.006%进行操作。

参考文献

[1]中华人民共和国药典. 2010年版，二部，附录Ⅷ P残留溶剂测定法[S].

[2]USP35-NF30.<467>Residual Solvents，185.

[3]ICH Q2A.Validation of Analytical Procedures： Definitions and Terminology.1994.

[4]ICH Q2B.Validation of Analytical Procedures： Methodology.1996.

作者简介：吴均静（1985-），女，助理工程师，化学制药专业，从事原料药生产工艺监督和检验分析工作。