桉树根区土壤中抑草真菌的筛选分离

张 奇, 胡文文, 林晓丹, 李家玉, 梁友谊, 杨 特, 何海斌

(福建农林大学生命科学学院/农业生态研究所，福建 福州 350002)

桉树根区土壤中抑草真菌的筛选分离

张 奇, 胡文文, 林晓丹, 李家玉, 梁友谊, 杨 特, 何海斌

(福建农林大学生命科学学院/农业生态研究所，福建 福州 350002)

通过平板稀释法分离纯化菌株，以莴苣和稗草为受体对候选菌株发酵液进行抑草潜力评价，得到1株高抑制率的菌株.形态学观察结合18S rDNA测序鉴定为曲霉真菌，命名为FJ-Z10.土壤盆栽试验结果表明，该菌株发酵液10倍稀释液对白菜根长和株高的抑制率分别为65.88%和18.97%；对白萝卜根长和株高的抑制率分别为43.35%和19.55%；对稗草根长和株高的抑制率分别为60.12%和55.00%；对水稻生长没有明显影响.该真菌可应用于稻田除草，但不适用于蔬菜田除草.

桉树; 根区土壤; 抑草; 真菌

化学除草剂具有作用迅速、使用方便等优点,在农田杂草防治中发挥重要作用.但是，化学除草剂的大量和长期使用也带来了诸如除草剂残留、杂草抗性增强、农田和水体污染等负面作用，给人类健康和生态环境带来不良影响，引起各国政府和研究人员的高度重视[1-4].

微生物除草剂是指在人为控制条件下，选用人工培养繁殖技术获得的、用于防治杂草的生物制剂，目前以真菌除草剂为主.在杂草与农作物亲缘关系相近的情况下，由于真菌侵染具有特异性，使用真菌除草剂可以防控杂草而不影响作物的正常生长，可连续使用.使用微生物除草剂可以避免化学除草剂的非选择性除草以及长期使用导致的杂草抗性增强，在降低化学除草剂的使用量、保护农业生态环境等方面具有较高的生态效益和社会效益[5-7].

研究表明，桉树除了对土壤中的水分和养分具有非常强的竞争力外，还具有较强的化感作用[8-10].近期研究表明，植物化感作用源于植物自身分泌的化感物质的直接作用[11-13].同时化感物质还会影响根际微生物群落结构与微生态系统，从而影响受体植物产生抑制作用的机制[14-18].本研究是根据植物化感作用对土壤微生物影响的潜在机制，探讨从桉树根区土壤中筛选具有抑草作用的微生物资源，为微生物除草剂的开发和应用提供依据.

1 材料与方法

1.1 供试材料

真菌基因组提取试剂盒购自生工生物工程(上海)股份有限公司；TaKaRa TaqTMHS Perfect Mix、pMD®18-T Vector购自宝生物工程 (大连) 有限公司.采用真菌专属培养基即PDA固体培养基(纯化培养基)、PDB培养基(发酵培养基)和马丁孟加拉红培养基(分离培养基含1 g·L-1氯霉素和2 mL·L-1庆大霉素)，所有培养基都经过灭菌处理.

莴苣、萝卜、小白菜种子购自福州永荣种子有限公司.Ⅱ优航2号水稻种子购自中种集团福建农嘉种业股份有限公司.稗草种子采自福建省福州市福建农林大学田间实验田.

1.2 菌株筛选

按5点取样法，取福建农林大学博学楼与生科楼之间种植的桉树根部周围无草区域的土壤；混匀后，按四分法取样10 g.菌株的分离参考文献[19].菌株培养4 d后观察其生长形态.根据各菌落形态特征，挑选生长特征各异的菌株各1株，继续用PDA固体培养基(纯化培养基)进行纯化，重复3次后获得单一菌株.将上述单一菌株用PDB培养基(发酵培养基)在摇床 (120 r·min-1，28 ℃) 上发酵10 d，发酵液用双层滤纸抽滤后，用于后续试验.

1.3 发酵液抑草能力测试

以莴苣为受体，对发酵液抑草活性进行测定：在组培皿中加入5 mL的发酵液，每个组培皿中播入5株刚冒芽的莴苣，以蒸馏水为对照，设置3个重复；组培皿放置于培养箱，28 ℃下培养3 d，测定莴苣的根长和株高[20].以稗草为受体，采用同样方法进行进一步验证.选取具有高效抑草作用的菌株进行后续试验.

1.4 生长曲线绘制

在操净台上，取30 mL已灭菌的PDB培养基(发酵培养基)，装入50 mL的离心管(已灭菌)；将FJ-Z10菌落用0.8 cm的打孔器在菌落的边缘打孔，把打下的菌饼放入离心管，做9个菌饼样品管；样品管放在28 ℃、160 r·min-1温控摇床上，24 h后取1管样品，然后每48 h取1管样品.将样品管中发酵液过滤，菌丝放在40 ℃的烘箱中烘干，冷却后称重.重复3次.以天数为横轴，以菌体干重为纵轴，绘制生长曲线.

1.5 菌株形态学初步鉴定

利用高倍显微镜观察菌丝的形态以及分生孢子的形态，对FJ-Z10菌株进行形态学初步鉴定[21].

1.6 菌株18S rDNA测定

利用真菌基因组试剂盒提取纯化的FJ-Z10真菌的基因组DNA.根据真菌鉴定的特异性引物，即上游引物NS1：5′-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3′，下游引物NS6：5′-GCATCACAGACCTGTTATTGCCTC-3′，对菌株进行18S rDNA测定.目的片段大小约为1300 bp.PCR扩增体系为50 μL，其中2×TaKaRa TaqTMHS Perfect Mix 25μL、上下游引物(20 μm·mL-1)各1 μL，DNA 1 μL，补充灭菌去离子水至50 μL.反应条件为94 ℃ 4 min预变性后进入循环，循环参数为94 ℃45 s、55 ℃45 s、72 ℃60 s，35个循环后，72 ℃延伸10 min.取PCR产物5 μL，在1%(质量分数)琼脂糖凝胶上电泳.PCR产物经胶回收试剂盒纯化后与pMD18-T载体连接，转化DH5α感受态细胞，用PCR和双酶切方法鉴定重组质粒.阳性重组质粒委托生工生物工程(上海)股份有限公司进行序列测定，并将序列信息经NCBI数据库分析比对.

1.7 筛选菌株的盆栽试验

盆栽试验在田间网室的自然环境下进行.取稻田土自然晾干，碾碎后去除土中的碎石和杂物，过筛.称取过筛后的细土120 g置于塑料盆(直径12 cm，高6 cm)中.将已催芽的稗草、水稻、小白菜和白萝卜的种子5粒播入土壤表层.对FJ-Z10菌株发酵液进行3个梯度稀释.处理1：稀释3倍.处理2：稀释5倍.处理3：稀释10倍.分别将各梯度的30 mL稀释液浇于种子周围.对照为蒸馏水.每个处理重复3次.每天用喷雾器添加蒸馏水以保持土壤湿润.种植5 d后测定受体植株的根长和株高.

1.8 数据处理

采用Excel软件绘制图表，采用单因素方差分析和Dunnett Two-sided Test 进行显著性差异分析.对受体生长状况的影响采用抑制率来评价.受体相对抑制率(IR)的计算公式表示如下：

IR=(1-处理组生长指标/对照组生长指标)×100%.

2 结果与分析

2.1 供试菌株抑草能力

2.1.1 供试菌液对莴苣生长的影响 经分离纯化，获得20个单一菌株.通过室内测试试验，发现具有抑制作用的菌株有10株；其中2号、3号、7号、8号和10号真菌菌株对莴苣根长和株高的抑制率都达到了100%(图1、2).

图1 供试菌液对莴苣根长的影响Fig.1 Effects of fungi ferments on the root length of lettuce

图2 菌液对莴苣株高的影响Fig.2 Effects of fungi ferments on the shoot length of lettuce

2.1.2 供试菌液对稗草生长的影响 从表1可以看出，对莴苣抑制率高的菌株大多数对稗草生长的抑制作用大.10号菌株对稗草生长的影响最大，对根长和株高的抑制率分别为100%和82.1%.该菌株命名为FJ-Z10.

2.2 筛选菌株的生物学特性

2.2.1 生长曲线 菌株FJ-Z10的菌体干物质重随时间的变化而变化(图3).前3 d为菌体生长迟缓期；第9天干物质重达到最大，为0.325 g；10 d后菌体的干物质重呈直线下降.由此可见10号菌株的生长周期为17 d左右，菌体的发酵量在9 d左右达到最大.

表1 菌株发酵液对稗草生长的影响Table 1 Effects of fungi ferments on the growth of barnyard grass

图3 菌株FJ-Z10的生长曲线Fig.3 The growth curve of strain FJ-Z10

2.2.2 菌株形态学鉴定 从图4可以看出，菌株FJ-Z10在PDA培养基中28℃下培养2 d,菌落大小中等，菌株表面黑色，边缘白色，表面丘状隆起，疏松无同心环，质地呈毡状，表面无渗出物.镜检结果显示营养菌丝无横隔，光滑色淡；孢囊梗直立不分枝；分生孢子头呈不规则的圆球形，呈放射状；分生孢子呈球形.通过对菌落形态的显微镜观察，根据文献[21]可初步确定FJ-Z10菌株属曲霉科的杂色曲霉.

2.2.3 菌株18S rDNA测定 将测序结果经SeqMan进行序列拼接后，经NCBI数据库进行BLAST分析，结果表明：其与Aspergillus即曲霉菌属中的菌株的亲源性最近；其与Aspergillusnigerstrain CS 1-1的18S rDNA序列核苷酸同源性高达99%，处于同一遗传进化分支(图5).结合形态学鉴定，结果表明其为曲霉属.

2.3 抑草潜力盆栽试验

土壤盆栽试验结果表明，不同浓度的FJ-Z10发酵液对白菜、萝卜和水稻的生长都有较大的抑制作用，且随着浓度的降低抑制作用减弱.稀释10倍后的发酵液对萝卜根长和株高的抑制率分别为43.35%和19.55%，对白菜根长和株高的抑制率分别为65.88%和18.97%，对水稻的生长没有影响.不同浓度下的FJ-Z10发酵液对稗草的抑制作用曲线呈锯齿状，但稀释10倍后的发酵液对稗草根长和株高的抑制率仍为60.12%和55.00%，因此在此浓度下的发酵液具有较好的应用价值.

表2 FJ-Z10菌株发酵液对白菜、萝卜、稗草和水稻的影响1)Table 2 Effects of fungi ferments of FJ-Z10 strain on the growth of Chinese cabbage, radish, barnyard grass and rice

1)处理1：菌液稀释3倍.处理2：菌液稀释5倍.处理3：菌液稀释10倍.

图5 菌株FJ-Z10系统发育树Fig.5 The phylogenetic tree of FJ-Z10 strain

3 讨论

(1)桉树的化感物质对于植物根系、幼苗的生长和叶片的光合作用有抑制作用，如尾叶桉叶片的提取液对绿豆(PhaseolusaureusRoxb.)和豌豆(PisumsativumL.)的插条的生根有非常强的抑制作用[22].巨尾桉枝叶的水浸提物对水稻(OryzasativaL.)、蕹菜(Ipomoeaaquatica)和菜苔(Brassicaparachinensis)的种子萌芽有不同程度的影响[23].巨尾桉叶片的水抽提物对小麦(TriticumaestivumL.)种子的萌发和幼苗生长有显著影响[24].本研究结果表明桉树释放的物质能够有效抑制周围杂草生长，因此也必然影响桉树根区土壤的微生物群落结构和微生态系统.因此可以从桉树根际土壤中寻找具有抑草活性的微生物资源并加以开发利用.

(2)本研究采用马丁孟加拉红培养基作为选择培养基，以莴苣和稗草为受体，测定结果表明桉树土壤具有较高抑草活性的菌株(FJ-Z10)，并对该菌株进行了生长曲线研究和形态学与分子生物学鉴定，结果表明其为曲霉属.

(3)将FJ-Z10菌株的发酵液对稗草、萝卜、白菜和水稻进行土壤盆栽试验，结果表明：稀释10倍后的菌株发酵液对稗草根长的抑制率为60.12%，株高抑制率为55.00%,这与前人的研究结果[25]相符；FJ-Z10菌株发酵液对白萝卜根长抑制率为43.35%，对株高的抑制率为19.55%；FJ-Z10菌株的发酵液对小白菜根长抑制率为65.88%，对株高抑制率为18.97%；它对水稻的生长没有明显影响.本研究从桉树根区土壤中分离到1株具有强抑草作用真菌菌株，该真菌可应用于稻田除草，但不适合于蔬菜地的除草.对菌株进行抑草物质分析以明确其中主要抑草物质及其机理，还有待进一步研究.

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(责任编辑:叶济蓉)

Isolation of a high herbicidal fungal strain from rhizospheric soils ofEucalyptus

ZHANG Qi, HU Wen-wen, LIN Xiao-dan, LI Jia-yu, LIANG You-yi, YANG Te, HE Hai-bin

(College of Life Sciences/Agroecological Institute, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou, Fujian 350002, China)

One microbial strain was successfully isolated and purified from the rhizospheric soils by plate dilution method with fungi medium, cooperating with laboratory bioassay using lettuce and barnyard grass as target plants. This strain, named FJ-Z10, was identified as fungusAspergillusby the morphology and 18S rDNA sequences. In pot culture experiments, the inhibitory rates of a 10-fold dilution of this strain ferments on root length and plant height were 65.88% and 18.97% of Chinese cabbage, 43.35% and 19.55% of radish, and 60.12% and 55.00% of barnyard grass, respectively. However, there was no significant effect on rice growth. The results demonstrated that this fungal strain could be used to control agricultural weeds but was not suitable to control vegetable weeds.

Eucalyptus; rhizospheric soil; herbicidal activity; fungi

2014-10-11

2015-01-21

国家自然科学基金资助项目(31070447、31370380);福建省自然科学基金资助项目(2012J01077);福建省大学生创新训练计划项目(1112C1243).

张奇(1989-)，男，硕士研究生.研究方向：化学生态学.Email:1185458937@qq.com.通讯作者何海斌(1965-)，男，教授,博士，博士生导师.研究方向：植物化学与化学生态学.Email:alexhhb@163.com.

Q939

A

1671-5470(2015)02-0159-06

10.13323/j.cnki.j.fafu(nat.sci.).2015.02.009