一株分离自铀矿土壤的苏云金芽孢杆菌的鉴定

张巧铃, 邱淑惠, 张永嵘, 黄天培

(福建农林大学生物农药与化学生物学教育部重点实验室，福建 福州 350002)

一株分离自铀矿土壤的苏云金芽孢杆菌的鉴定

张巧铃, 邱淑惠, 张永嵘, 黄天培

(福建农林大学生物农药与化学生物学教育部重点实验室，福建 福州 350002)

从新疆某铀矿厂土样中分离出1株芽孢杆菌，初步确定为苏云金芽孢杆菌(Bt)，命名为BRC-ZYR3.该菌株含有3种cry1类基因(cry1Ba、cry1Bb、cry1Be/1Bf)和2种cry9类基因(cry9Ca和cry9Da).Bt BRC-ZYR3可产生5种杀虫晶体蛋白，分别为130、70、50、30和25 ku.此外，该菌株能耐受25 mg·L-1Cr(VI)，并在72 h内将其还原至3.8 mg·L-1.

Cr(VI); 苏云金芽孢杆菌; PCR-RFLP; SDS-PAGE

重金属被广泛应用于工业生产和人们的日常生活，与此同时，重金属污染成为了全球面临的一个重要问题[1].我国重金属污染事故频发：2011年云南曲靖铬渣非法倾倒、2012年广西龙江河的镉污染、2013年湖南“镉大米事件”等.传统的重金属修复技术包括物理化学法、农业化学调控法以及垃圾堆肥法等，存在成本高、易产生二次污染、破坏土壤理化性质等问题，难以大面积推广应用[2].经过多年的探索和研究，用微生物修复技术治理重金属污染被看作是一个有效策略[3].

苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis，Bt)是具有杀虫活性的革兰氏阳性细菌，在自然界中分布广泛.其最大的特点是在芽孢形成过程中能够产生1个或多个伴孢晶体，亦称杀虫晶体蛋白(insecticidal crystal proteins,ICPs)[4].Bt杀虫剂对人畜无害、不污染环境，因而在生物防治中占有极其重要的地位[3].土壤作为微生物生存的最佳介质，也是Bt分布最为丰富的生境，从不同生态环境的土壤样品中分离、筛选及开发利用天然的Bt菌株，始终是一项重要的研究任务[5].本试验从新疆某铀矿厂采集的土样中分离得到1株Bt菌株，进一步利用PCR-RFLP鉴定体系和SDS-PAGE技术研究该菌株的杀虫晶体蛋白基因类型和表达情况，并分析其对Cr(VI)的还原能力及耐受性，以期为利用Bt进行生物防治的同时有效治理Cr(VI)污染提供依据.

1 材料与方法

1.1 土样采集与菌株分离

土样来源于新疆某铀矿厂，采集其土表以下3 cm左右的土壤，装入采集袋中备用.采用醋酸钠—抗生素筛选法[6]筛选菌株.

1.2 培养基、试剂与酶

配制液体LB、固体LB、固体1/2 LB培养基以及生理生化培养基；配制碱性复红染色液、1%酸性复红水溶液、5% α-萘酚乙醇、1.6%溴甲酚紫、20%尿素溶液、5% FeCl3水溶液、40% KOH溶液、Lugco碘液.PCR所用试剂和限制性内切酶均购自TaKaRa公司.

1.3 显微样品制备与晶体观察

将菌株接种于1/2 LB培养基上，每隔6-8 h肉眼观察菌落形态，取样并按常规的石炭酸复红染色方法进行染色，观察有无营养体、孢子囊、芽孢、伴孢晶体生成，共观察3 d.

1.4 主要生理生化指标的鉴定

典型生理生化指标的测定，包括各种糖的利用、淀粉水解、乙酰甲基甲醇(V.P)反应、脲酶水解、七叶灵利用、卵磷脂酶、精氨酸脱羧酶、菌膜形成[7].

1.5 Btcry基因型的鉴定

以Bt质粒DNA作为PCR模板，合成10对cry1-cry10基因通用鉴定引物，利用PCR-RFLP对该菌株的cry基因型进行鉴定[8].

1.6 Bt杀虫晶体蛋白的分析

收集Bt孢晶混合物，进行SDS-PAGE电泳[9].

1.7 对Cr(VI)还原能力及耐受性分析

向含有25 mg·L-1Cr(VI)的培养基中接种Bt菌株，每隔12 h取样，测量体系中剩余Cr(VI)的浓度，以分析Bt对Cr(VI)的还原情况[10].将Bt菌株适量接种于不同Cr(VI)浓度(0、25、50、75、100 mg·L-1)的培养基中，6 h后取样，测定Cr(VI)的浓度，以分析Bt对Cr(VI)的耐受性[10].

2 结果与分析

2.1 菌株的分离与形态学鉴定

源自铀矿的土壤样品经醋酸钠—抗生素分离法处理后，挑取到1个类似Bt的菌落，将其接种到1/2 LB固体培养基中，30 ℃培养2 d，菌落呈乳白色且有粗糙褶皱，边缘不整齐，单菌落呈圆盘状，在1/2 LB平板培养时在菌苔边缘出现明显的辐射状；液体培养时，摇匀后均匀浑浊，无明显的颗粒状；制片时菌斑亦均匀平整，未见颗粒状；经复红染色后于光学显微镜下观察发现，其营养体呈杆状，菌端钝圆；孢子囊呈杆状，比营养体稍膨胀，囊内一端为芽孢，另一端有伴孢晶体；当孢子囊破裂时释放出芽孢和晶体，芽孢呈透明卵圆形，伴孢晶体呈紫色菱形(图1).根据菌株形态学分析，将该菌株初定为Bt，并命名为BRC-ZYR3.

A：营养期；B：孢子囊期；C：裂解期.图1 光学显微镜下的Bt菌株BRC-ZYR3Fig.1 Morphology of Bt BRC-ZYR3 observed under the optical microscope

2.2 菌株的生理生化鉴定

对分离株BRC-ZYR3的典型生理生化指标进行测定.结果表明，该菌株对各种糖的利用、淀粉水解、乙酰甲基甲醇(V. P)、脲酶水解、七叶灵利用、卵磷脂酶、精氨酸脱羧酶、菌膜形成均呈阳性反应，该鉴定结果与伯杰氏细菌鉴定手册中Bt的鉴定内容[11]相符，确认BRC-ZYR3为Bt.

2.3 菌株cry基因型的鉴定

以分离到的菌株BRC-ZYR3质粒DNA作为模板，利用PCR-RFLP方法对BRC-ZYR3的cry基因型进行鉴定.其中，由通用引物K5un2/K3un2扩增出约1.6 kb的目的条带，说明菌株BRC-ZYR3含有cry1/cry7/cry9型基因.对扩增产物进行限制性内切酶XbaⅠ/PstⅠ双酶切分析，通过比对，初步确定该菌株所含cry1型基因为cry1Ba、cry1Bb和cry1Be/1Bf组合，所含cry9型基因为cry9Ca和cry9Da组合，不含cry7型基因(图2).

2.4 菌株伴孢晶体蛋白的SDS-PAGE分析

SDS-PAGE分析结果表明，菌株BRC-ZYR3的晶体主要由分子质量为130、70、50、30和25 ku的蛋白组成(图3).研究表明，通常cry1/cry7/cry9型基因编码的蛋白为130 ku[12]，说明PCR-RFLP分析正确.

M：DNA分子质量标准；1：以K5un2和K3un2为引物，以Bt BRC-ZYR3的质粒为模板扩增的cry1/cry7/cry9基因PCR产物；2：以Bt BRC- ZYR3的cry1/cry7/cry9基因PCR产物为模板，用PstⅠ和XbaⅠ双酶切得到的片段.图2 利用PCR-RFLP技术分析Bt BRC-ZYR3菌株的cry基因型Fig.2 Detection of cry gene types of Bt BRC-ZYR3 with PCR-RFLP M：蛋白质分子质量标准；1：Bt BRC-ZYR3 ICPs.图3 Bt BRC-ZYR3杀虫晶体蛋白SDS-PAGE电泳分析Fig.3 SDS-PAGE analysis of Bt BRC-ZYR3 ICPs

2.5 菌株Cr(VI)还原能力及耐受性分析

Bt BRC-ZYR3可耐受25 mg·L-1Cr(VI)，72 h后，Bt BRC-ZYR3可将Cr(VI)浓度降至3.8 mg·L-1.

3 讨论

本研究通过醋酸钠—抗生素法对含铀矿的土壤样品进行分离，获得1株菌株，其形态和主要生理生化指标与Bt相符，被命名为BRC-ZYR3.

Bt作为目前应用最为广泛的一种微生物杀虫剂，其杀虫活性与cry基因编码的杀虫晶体蛋白的特异性密切相关[13].Bt不同亚种的杀虫晶体蛋白可由单一或多个不同大小级别的毒蛋白组成[14].本研究采用PCR-RFLP鉴定体系对BRC-ZYR3进行cry基因型鉴定.结果表明：该菌株含有cry1Ba、cry1Bb、cry1Be/1Bf、cry9Ca和cry9Da5种cry基因.据报道，cry1类毒素蛋白对鞘翅目昆虫具有毒杀活性，其中cry1Ba的毒素蛋白对小菜蛾表现出较高的活性；cry9类毒素蛋白对甜菜夜蛾有高毒力[15-16].比较SDS-PAGE结果与cry基因型发现，该菌株表达约130 ku的晶体蛋白，这与PCR-RFLP检测含有cry1和cry9基因表达的蛋白大小一致.此外，SDS-PAGE结果显示，菌株还表达70、50、32和25 ku的蛋白，而PCR-RFLP未检测出相应大小的蛋白.通常大小为70 ku的蛋白是cry2类产物，50 ku的蛋白可能是Cry2Ab的降解产物，也可能是其他未知cry型基因编码产物，对其有待进一步研究.由此可知，PCR-RFLP结果不能完全反映这些基因在菌株中的表达情况，不足以证明菌株的杀虫效果，而SDS-PAGE结果更能明确Bt菌株可能的杀虫效果[17].

近年来，微生物治理重金属污染备受重视，即利用原土壤中的土著微生物对特定重金属吸收、沉积，从而修复被污染土壤[18].本研究表明，Bt BRC-ZYR3可耐受25 mg·L-1Cr(VI)，且72 h后，可将其还原至3.8 mg·L-1.本实验室前期研究表明，从源自水样、土壤、植物、动物粪便、食品、昆虫和饮料的Bt菌株中都能筛选出快速还原Cr(VI)的菌株[3]，表明Bt有望在被作为生物农药应用的同时，治理Cr(VI)污染，这是值得深入研究的一个方向.

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(责任编辑:杨郁霞)

Identification of aBacillusthuringiensisstrain isolated from uranium soil

ZHANG Qiao-ling, QIU Shu-hui, ZHANG Yong-rong, HUANG Tian-pei

(Key Laboratory of Biopesticide and Chemical Biology, Ministry of Education, Fujian Agricultureand Forestry University, Fuzhou, Fujian 350002, China)

A soil sample was collected from a factory of uranium-mine in Xinjiang Province, China. A new isolate, designated as BRC-ZYR3, was identified asBacillusthuringiensis(Bt). The results showed that Bt BRC-ZYR3 harboredcry1Ba,cry1Bb,cry1Be/1Bf,cry9Caandcry9Dagenes and encoded 130, 70, 50, 30 and 25 ku insecticidal crystal proteins (ICPs). And Bt BRC-ZYR3 resistant to 25 mg·L-1Cr(VI) could reduce Cr(VI) to 3.8 mg·L-1.

Cr(VI);Bacillusthuringiensis; PCR-RFLP; SDS-PAGE

2014-01-27

2014-04-18

“十二五”农村领域国家科技计划课题(2011AA10A203)；国家自然科学基金(31201574、31071745)；福建省教育厅项目“教育厅高校领军人才”(k8012012a).

张巧铃(1988-)，女，硕士研究生.研究方向：微生物分子生物学.Email：qiaoling068@163.com.通讯作者黄天培(1979-)，男，副研究员，博士.研究方向：微生物药物.Email：tianpeihuang@126.com.

Q89

A

1671-5470(2015)02-0131-04

10.13323/j.cnki.j.fafu(nat.sci.).2015.02.004