益肾养阴合剂对MRL/lpr小鼠免疫调节机制的研究

李东云，张巍琼，顾玲丽，吴 洋

(1.云南省昆明市中医医院，云南 昆明 650011；2.云南省中医医院，云南 昆明 650011)

益肾养阴合剂对MRL/lpr小鼠免疫调节机制的研究

李东云1，张巍琼1，顾玲丽1，吴 洋2△

(1.云南省昆明市中医医院，云南 昆明 650011；2.云南省中医医院，云南 昆明 650011)

目的 探讨益肾养阴合剂对MRL/lpr小鼠中的CD4+、CD8+、IFN-γ、IL-l0的影响。揭示益肾养阴合剂对MRL/lpr小鼠免疫紊乱发挥疗效作用的调节。方法 将C57BL/6雄性小鼠分2组，第1组生理盐水对照；第2组正常中药组(益肾养阴合剂)。再将 MRL/1pr 雄性小鼠随机分为4组：第3组为生理盐水对照组；第4组为中药组(益肾养阴合剂)；第5组为中西药组(益肾养阴合剂+醋酸泼尼松片)；第6组为西药组(醋酸泼尼松片)。各组小鼠均为10只。予每日灌胃连续治疗4周。4周后处死，取各组小鼠(每组取5只)新鲜脾脏组织进行研磨、淋巴细胞分离后，用流式细胞术检测CD4+、CD8+细胞比例；再取余下各组5只小鼠新鲜脾脏组织为两部分，一部分用ELISA法检测组织IL-10、IFN-γ浓度；另一部分运用RT-PCR实验检测IL-10、IFN-γmRNA含量。结果 1.4组MRL/1pr小鼠CD4+较C57BL/6小鼠低且治疗后以中药加激素组升高明显(P<0.05)；4组MRL/1pr小鼠CD8+较C57BL/6小鼠高，在治疗后，中药加激素组较MRL/1pr小鼠生理盐水组降低(P<0.05)；CD4+/CD8+的比值中4组MRL/1pr小鼠与C57BL/6治疗前无差异且MRL/1pr比值最低，给予治疗后以MRL/1pr中药配合激素组升高最为明显(P<0.05)。2.MRL/1pr小鼠IL-10较C57BL/6小鼠有不同程度升高，经治疗后以中药配合西药组降低明显(P<0.05)；MRL/1pr小鼠IFN-γ较C57BL/6小鼠有不同程度降低，经治疗后以中药配合西药组升高明显(P<0.05)；IL-10 mRNA、IFN-γ mRNA的表达6组间比较差异性与蛋白变化(ELISA结果)一致。结论 益肾养阴合剂可通过对CD4+、CD8+、IFN-γ、IL-10的调节缓解MRL/1pr小鼠病情，且治疗调节了CD4+/CD8+比例，说明益肾养阴合剂对调节MRL/1pr小鼠免疫紊乱具有一定疗效。

益肾养阴合剂；MRL/1pr小鼠；免疫调节

系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus，SLE)是自身免疫介导的，以免疫性炎症为突出表现的弥漫性结缔组织病。流行病学研究显示，我国患病率为70/10万，妇女中则高达113/10万人，其5年存活率为90%，10年存活率为80%[1]。通常以皮肤损害的红斑为主称为“阴阳毒”。阐明免疫细胞的机制研究对SLE的发病作用，探寻新的治疗靶点及制定个性化治疗方案有着重要的意义。

益肾养阴合剂是根据云南省中医医院风湿科常见的协定方药，该方具有益气固肾、养阴清热之功效，其主要组方为黄芪生脉六味二至丸加减化裁而成(黄芪、党参、麦冬、五味子、女贞子、旱莲草、熟地、山药、山茱萸、泽泻、牡丹皮、茯苓、金樱子、甘草)。该方在临床上使用证实具有益气固肾、养阴清热，治疗系统性红斑狼疮的相应免疫调节作用。本文就是探索该方是否对免疫紊乱具有调节作用的功效。

1 材料与方法

1.1 实验材料及动物 纯种6～8 周MRL/1pr 雄性小鼠，40只,体重(28.0±3.0) g, C57BL/6背景小鼠6～8周,雄性20只(与MRL/1pr小鼠为同种系)，SPF级,2种小鼠均由南京大学-南京生物医药研究院提供(由美国Jackson实验室引进)，许可证号：SCXK(苏)2010-0001。益肾养阴合剂(黄芪30 g，党参20 g，麦冬20 g，五味子10 g，女贞子15 g，墨旱莲15 g，熟地15 g，山药15 g，山茱萸10 g，泽泻10 g，牡丹皮10 g，茯苓15 g，金樱子10 g，甘草5 g)共200 g。中药由云南省中医医院煎药房统一煎煮，4℃冰箱保存。醋酸泼尼松片，由云南省中医医院药房提供，(重庆科瑞制药(集团)有限公司，批号：H50020459，规格：5mg/片)。

1.2 试剂与仪器 高速微量离心机、酶标仪(Molecular Devices)、核酸蛋白检测仪、流式细胞仪(CyFlow Space)、IFN-γ ELISA试剂盒、IL-10 ELISA试剂盒(美国RayBiotech，Inc)、Rat anti mouse CD4 流式抗体、Rat anti mouse CD8 流式抗体(北京四正柏)等。

2 实验方法

2.1 动物分组与给药

2.1.1 药物制备 中药煎煮加800 mL水，煎煮20 min后，煎煮得到200 mL中药汤剂。小鼠每次给药为0.3 mL/20 g体重[2](相当于生药量1.15 g/mL)。成人激素量为5 mg/d，则小鼠激素用量为0.013 mg/20 g ,则用激素量加蒸馏水制备0.3 mL/20 g悬液。

2.1.2 动物分组以及给药方式 两种同种系不同品种小鼠共分为6组，每组10只。将C57BL/6雄性小鼠分2组，第1组生理盐水对照；第2组正常中药组(益肾养阴合剂)。再将MRL/1pr雄性小鼠随机分为4组：第3组为生理盐水对照组；第4组为中药组(益肾养阴合剂)；第5组为中西药组(益肾养阴合剂+醋酸泼尼松片)；第6组为西药组(醋酸泼尼松片)。各组小鼠均为10只。予以每日灌胃连续治疗28 d。

2.2 标本制备 给药4周后，在无菌RNase环境下，用腹腔麻醉小鼠(0.001ml/g体重)，分离取材各组5只小鼠脾脏组织，一部分放入无菌Rnase的EP管中，用作RT-PCR实验，一部分放入无菌的EP管中，用作ELISA实验。

2.3 流式细胞仪检测CD4+、CD8+细胞比例 (1)将各组5只小鼠脱颈处死，在超净台中分离出小鼠脾脏，无菌操作；进行脾脏研磨，室温离心，吸出淋巴细胞层再室温离心收集细胞并计数；(2)取上述制备好的小鼠淋巴细胞，每只小鼠的脾脏细胞平均分为A、B、C、D 4管，A管为空白管，B管中加入10 μL CD4-FITC流式抗体，C管中加入10 μLCD8-PE流式抗体，D管中各加入CD4-FITC和CD8-PE流式抗体，均与管底细胞混匀，室温避光孵育20 min；制成单细胞悬液，上流式细胞仪检测CD4+，CD8+。

2.4 ELISA实验步骤

2.4.1 样本制备 取出备用脾脏组织，裂解后上超声细胞破碎仪冰浴上匀浆至均匀无颗粒，取上清。

2.4.2 操作步骤 准备试剂，在酶标板上每孔对应加入样品、标准品。4℃孵育过夜，加入检测抗体，室温孵育1h ，加入100μL 工作液，室温孵育45min，加入100μL 底物试剂，室温孵育30min，每孔加入50μL终止液，酶标仪上450nm波长处读数。

2.5 RT-PCR实验检测IL-10、IFN-γ mRNA含量 查找mouse的IFN-γ和IL-10的mRNA序列，送交广州合成。提取总RNA，合成cDNA第一条链，再用PCR法扩增目的基因，用琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，运用BIO-RAD凝胶成像系统进行凝胶成像，用Image J软件测量灰度值，最后测目的基因和内参β-actin电泳条带灰度值的比值进行统计学分析。

3 结果

3.1 流式检测结果 见表1、图1。

表1 各组小鼠脾脏淋巴细胞CD4+、CD8+细胞的流式检测结果

图1 各组小鼠脾脏淋巴细胞CD4+、CD8+细胞的流式检测图

3.2 ELISA检测IL-10和IFN-γ结果 表2。

表2 各组小鼠脾脏组织中IL-10、IFN-γ ELISA检测结果

3.3 RT-PCR检测IL-10和IFN-γ mRNA结果 见表3、图2。

表3 各组小鼠脾脏组织中IL-10、IFN-γ RT-PCR灰度值比值分析结果(目的基因条带灰度值/β-actin条带灰度值，

注：*表示与C57BL/6+生理盐水组相比有统计学差异，P<0.05；○表示与C57BL/6+中药组相比有统计学差异，P<0.05；●表示与MRL/1pr+生理盐水组相比有统计学差异；△表示与MRL/1pr+中药组相比有统计学差异，P<0.05；▽表示与MRL/1pr +中药联合激素组相比有统计学差异；▲表示与MRL/1pr+激素组相比有统计学差异，P<0.05。

图2 各组小鼠脾脏组织中IL-10、IFN-γ mRNA基因表达情况

(泳道1代表C57BL/6+生理盐水组；泳道2代表C57BL/6+中药组；泳道3代表MRL/1pr+生理盐水组；泳道4代表MRL/1pr+中药组；泳道5代表MRL/1pr+中药联合激素组；泳道6代表MRL/1pr+激素组)

4 讨论

本次研究选择的细胞因子IFN-γ[3]及IL-10[4]，CD4+、CD8+在当今的SLE研究中出现对Th1/Th2的比值的影响较为广泛。通过调节外周血Th1/Th2型细胞因子平衡及提高CD4+/CD8+的比值可增强免疫应答已经是一个趋势，同时反向调节作用即通过CD4+/CD8+的比值反映Th1/Th2，辅助T细胞和调节性细胞的损伤的不平衡已经提出能够参与自身免疫性疾病如系统性红斑狼疮的发病机制。

本研究发现中IFN-γ水平的下降和IL-10水平的增高显然是有联系的，但根据笔者的实验结果只能显示两者之间的负相关，而不能推断它们的因果关系，IFN-γ下降或者是IL-10增高的先后顺序及谁起先导作用则待进一步完善研究。同时发现，中药配合激素对MRL/lpr小鼠CD4+/CD8+比值具有一定调节作用，也反映其Th1与Th2的比值可受反向调节分析存在可能，但Th1与Th2的分泌活动复杂，这也许只能为其中一项指标。了解Th1与Th2之间是否存在因果关系，对该病诊断、疗效等开辟新方向。

[1]中华医学会风湿病学分会.系统红斑狼疮诊断及治疗指南[J].中华风湿病学杂志,2010,14(5):342-346.

[2]熊远珍.实验动物与人用药量的新换算[J].江西医学院学报,1997,12(30):41.

[3]McMurray RW,Hoffman RW, Nelson W,Walker SE.Cytokine mRNA expression in the B/W mouse model of systemic lupus erythematosuseanalyses of strain,gender,and age effects[J].Clin Immunol Immunopathol,1997,84:260-268.

[4]Chong W.P,Ip W.K,Wong W.H,et al. Association of interleukin-10 promoter polymorphisms with systemic lupus erythematosus[J].Genes Immun,2004,5(6):484-492.

Study on the Effect of Yishen Yangyin Mixture on the Immune Regulation Mechanism of MRL/lpr Mice

LI Dong-yun1, ZHANG Wei-qiong1, GU Ling-li1, WU Yang2

(1.TraditionalChineseMedicineHospitalofKunmingCity,Kunming650000,Yunnan; 2.YunnanTraditionalChineseMedicineHospital,Kunming650000,Yunnan)

Objective: To study the effect of Yishen Yangyin Mixture (YYM) on CD4+, CD8+, IFN-γ and IL-l0 of MRL/lpr mice and reveal its regulation effect on immune disorders of MRL/lpr mice. Methods: C57BL/6 male mice were divided into two groups, the 1st saline group and the 2nd normal YYM group, and MR /1pr male mice were randomly divided into 4 groups, the 3rd normal saline group, the 4th YYM group, the 5th YYM+ prednisone tablet group and the 6th prednisone tablet group, 10 mice per group. Each group was fed daily for 4 consecutive weeks. Four weeks later, the mice were killed to get fresh spleen tissue from 5 mice to be grinded and after separation of lymphocytes, flow cytometry was used to measure CD4+, CD8+cell ratio. Then another fresh spleen tissue were taken from the remaining five mice and divided into two parts. One part was used to assay IL-10 and IFN-γ concentration by ELISA and the other part to assay IL-10 and IFN-γmRNA content by RT-PCR. Results: A. After the treatment, CD4+of the 4th group increased significantly (P<0.05) when compared with that of the 6th group, and CD8+of the 4th group was higher than that of the 6th group and lower than that of the 1st group(P<0.05). The CD4+/CD8+ratio of the 4th group had no obvious difference before the treatment and the ratio of MRL / 1pr mice was lowest, but increased obviously(P<0.05)after the treatment. B. IL-10 of MRL/1pr mice increased to varying degrees when compared with that of C57BL/6 mice, and after the treatment, IL-10 of the 5th group was significantly lower (P<0.05). IFN-γ of MRL/1pr mice reduced to varying degrees when compared with that of C57BL/6 mice and after the treatment, IFN-γ of the 5th group increased significantly (P<0.05). In comparison of IL-10 mRNA presentation of these 6 groups, difference and protein changes (ELISA result) were consistent. Conclusion: Yishen Yangyin Mixture can regulate CD4+, CD8+, IFN-γ and IL-10 to remit the illness of MR /1pr mice, and adjust CD4+/CD8+ratio, thus indicating that Yishen Yangyin Mixture has a adjusting effect on the immune disorders of MRL /1pr mice.

Yishen Yangyin Mixture, MRL/1pr mouse, immunomodulatory

李东云(1987-)，女，湖北，研究方向：中医痹证。

△通信作者：吴洋，Tel：13187705354，E-mail：451886900@qq.com

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