荧光光谱法研究纳米TiO2与肌红蛋白的相互作用

黄鹤勇, 周家宏, 冯玉英

(1. 南京师范大学 分析测试中心， 江苏 南京 210023； 2. 南京师范大学 地理科学学院， 江苏 南京 210023)

荧光光谱法研究纳米TiO2与肌红蛋白的相互作用

黄鹤勇1,2, 周家宏1, 冯玉英1

(1. 南京师范大学 分析测试中心， 江苏 南京 210023； 2. 南京师范大学 地理科学学院， 江苏 南京 210023)

采用溶胶-凝胶法合成TiO2纳米颗粒，通过TEM对纳米TiO2进行了表征。结果表明，纳米TiO2的粒径约为5～6 nm。利用荧光光谱法研究了纳米TiO2与肌红蛋白(Mb)的相互作用，研究表明这种相互作用能使肌红蛋白的内源荧光猝灭。通过猝灭常数、结合常数和结合位点数的计算，证明此猝灭为静态猝灭机制，结合位点数约为1。根据热力学参数确定了它们之间的作用力主要是静电力和疏水力，使肌红蛋白构象发生了变化。

纳米TiO2； 肌红蛋白； 荧光光谱； 相互作用

自从1985年日本学者Mstsunaga等[1]首次报道光激发TiO2有杀菌效果以来，TiO2光催化氧化在生物领域的应用研究引起了化学家、化学工程师和微生物家的极大关注，并很快成为人们研究的热点[2]。近年来，国内外有关TiO2光催化氧化法杀菌研究报道较多[3-8]，也有应用于人体内癌细胞杀伤作用的报道[9]。不过对TiO2与蛋白质作用的研究很少。本文研究纳米TiO2粒子与马心肌红蛋白(Mb)的结合作用。

由于固体表面-蛋白质吸附的体系比较复杂，本文采用最“简单”的体系。纳米TiO2采用溶胶-凝胶法制备，在缓冲体系中与Mb作用，通过荧光光谱研究纳米TiO2粒子对马心肌红蛋白(Mb)的猝灭作用，根据其猝灭曲线得出纳米TiO2粒子与肌红蛋白的猝灭常数以及它们的结合常数，并结合热力学参数确定了它们之间的作用力类型；同时用同步荧光光谱研究了纳米TiO2粒子浓度对Mb 的构象变化的影响。

1 实验

1.1 仪器与试剂

肌红蛋白为美国Sigma公司产品，使用前未经进一步的提纯，用二次去离子水配制0.04 mol/L混合磷酸盐溶液(pH=7.4)作缓冲液，肌红蛋白的浓度为5.26×10-6mol/L。其他试剂均为分析纯试剂。荧光光谱采用Perkin-Elmer公司的LS-50B型荧光光谱仪。透射电镜采用采用JEM-200CX 型透射电镜表征纳米TiO2的形态和晶粒大小，扫描加速电压为 160 kV。

1.2 纳米TiO2粒子的制备

量取4 mL钛酸四丁酯并溶解在20 mL的无水乙醇中，再加入适量冰醋酸，作为A液。量取20 mL的无水乙醇，再加入10 mL一定质量分数的盐酸(pH = 2左右)，作为B溶液。在磁力搅拌条件下将B液慢慢滴加到A中，滴加完毕继续搅拌5 h，即得到稳定透明的纳米TiO2溶胶。制得的纳米TiO2溶液用二甲基亚砜(DMSO)配制，浓度为1.0×10-3mol/L。

1.3 荧光光谱图的绘制

光谱测定：移取2.5mL蛋白质溶液于1cm的石英比色皿中，用微量注射器逐次加入10μL 的纳米TiO2溶液并混合均匀，LS 50 B型荧光光谱仪进行荧光测定。荧光发射与激发狭缝宽度均为10 nm，扫描速度500 nm/min,取波长差分别为20、80 nm，扫描得到同步荧光光谱。

2 结果与讨论

2.1 纳米TiO2的透射电镜图

纳米TiO2的透射电镜图如图1所示。由图可见，溶胶-凝胶法所制备的纳米TiO2为球形颗粒，其粒径约为5～6 nm。

图1 纳米TiO2的透射电镜图

2.2 TiO2对Mb的荧光猝灭光谱

蛋白质中由于色氨酸、酪氨酸的存在使其具有内源荧光。固定Mb的浓度([Mb]=5.26 μmol/L)，逐渐加入TiO2，以280 nm为激发波长(发射波长为330 nm)，扫描体系的荧光光谱见图2，图中[TiO2]=0,0.8,1.6,2.4,3.2,4.0,4.8 μmol/L。由图2可见，随着TiO2浓度升高，Mb的内源荧光强度有规律地降低，说明纳米TiO2对Mb的荧光有猝灭作用，它们之间存在相互作用。

图2 纳米TiO2与Mb相互作用的荧光发射光谱

2.3 荧光猝灭作用的Stern-Volmer分析

引起Mb荧光猝灭的原因可能有动态猝灭和(或)静态猝灭。动态猝灭是猝灭剂和荧光物质的激发态分子之间的相互作用过程，是与自发的发射过程相竞争从而缩短激发态寿命的过程，不影响蛋白质的结构和生理活性。静态猝灭则是由于发生了配合作用,通常是产生了不发荧光的配合物,对蛋白质的二级结构可产生影响，并可影响其生理活性。

碰撞猝灭过程遵循Stem-Volmer[10]方程;

(1)

式中，F0是猝灭剂不存在时的荧光强度，F为加入猝灭剂后的荧光强度，Ksv为动态猝灭常数，[Q]为猝灭剂浓度，Kq为双分子猝灭过程速率常数，τ0为猝灭剂不存在时荧光分子的平均寿命。

假定此过程为动态猝灭过程，根据式(1)，以荧光分子的荧光强度变化F0/F对猝灭剂浓度[TiO2]作图(见图3)，直线斜率代表荧光猝灭过程速率常数Ksv。从图3可以看出，随温度升高直线斜率减小，表明此猝灭过程不应为动态猝灭，而应为生成纳米TiO2-Mb复合物的静态猝灭。

图3 纳米TiO2与Mb作用的Stern-Volmer曲线

一般生物大分子的荧光寿命为10-8s[11]，由猝灭曲线斜率可求出猝灭过程速率常数(t=26 ℃，Kq=3.79×1011L/(mol·s)，相关系数R=0.988 9；t=45 ℃，Kq=2.96×1011L/(mol·s)，R=0.988 4)。但是，各类猝灭剂对生物大分子的最大扩散碰撞猝灭速率常数为2×1010L/(mol·s)[12]，很明显这里猝灭速率常数大于扩散控制的猝灭常数，说明上述猝灭速率过程不是由于纳米TiO2粒子对Mb动态碰撞引起的动态猝灭，而是由于纳米TiO2与Mb形成了复合物引起的静态猝灭。

2.4 结合位点数和结合常数

对于静态猝灭，有：

(2)

由图2统一读取280/330 nm处的荧光强度，按(2)式进行数据处理，得到图4，由斜率(26 ℃，n=0.996，R=0.987 3；45 ℃，n=1.21，R=0.987 0)知结合数n≈1，说明在水溶液中每一个Mb分子与一个纳米TiO2粒子结合形成复合物。

图4 lg[(F0-F)/F]对lg[TiO2]的线性拟合曲线

利用静态猝灭双倒数[7]公式

(3)

作Lineweaver-Burk曲线，见图5。由直线斜率求得纳米TiO2与Mb在不同温度下的离解常数KD，从而进一步求得结合常数KA=1/KD。得到26 ℃和45 ℃下的KA分别为3.67×103L/mol和2.02×103L/mol;相关系数R分别为0.993 5和0.993 7。

图5 纳米TiO2对Mb荧光猝灭的Lineweaver-Burk曲线

可见，纳米TiO2与Mb之间的结合常数较大，说明两者之间有较强的结合力。

2.5 结合的热力学参数及作用力

由此可见，△H<0，△S>0，两者之间的作用力应为静电力。Ross等[14]认为，很多情况下，即使△H<0，蛋白质和一些小分子之间主要作用力仍为疏水作用力。因此，可以认为纳米TiO2与Mb之间作用力为疏水力和静电力。

2.6 同步荧光法研究CF对Mb构象的影响

图6为Mb([Mb]=5.26 μmol/L)与不同浓度([TiO2]=0,0.8,1.6,2.4,3.2,4.0,4.8 μmol/L)的纳米TiO2作用后，步长△λ为20 nm和80 nm的同步荧光光谱。由图6可见，在Mb溶液中没有纳米TiO2的同步荧光光谱，△λ=20 nm时的Mb的荧光发射峰位于309 nm处(图6(a)，曲线0)，这是Mb中酪氨酸残基的发射峰。△λ=80 nm时的Mb的荧光发射峰均位于350 nm处(图6(b)，曲线0)，这是Mb色氨酸残基的发射峰。因为蛋白质中色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸是仅有的发荧光的氨基酸残基，其中苯丙氨酸通常以共振能的形式把自己的激发能转移到色氨酸残基上，所以在蛋白质中通常观察不到苯丙氨酸的荧光发射峰，只能观察到色氨酸和酪氨酸残基的荧光光谱[9]。而且当△λ=20 nm时，蛋白质的荧光光谱表现为酪氨酸残基的荧光发射峰，而当△λ=80 nm时，为蛋白质中色氨酸残基的荧光发射峰[15]。

图6 Mb的同步荧光光谱

当在Mb溶液中加入纳米TiO2后，酪氨酸和色氨酸残基的发射峰均发生红移，峰强度也有明显的降低。当溶液中加入4.8 μmol/L纳米TiO2后，酪氨酸残基的荧光发射峰位于318 nm，红移9 nm，强度下降61%；色氨酸残基的发射峰位于353 nm处，红移3 nm，强度下降56%。峰位红移和峰强下降表明纳米TiO2与Mb作用后，使Mb分子的构象发生了变化，以致其氨基酸残基所处的微环境也发生了变化。

根据Stern-Volmer方程：F0/F=1+Ks[Q]，通过对荧光数据进行处理，还可以得到纳米TiO2猝灭Mb分子中的酪氨酸和色氨酸残基的动力学参数。纳米TiO2对Mb分子中酪氨酸和色氨酸残基的荧光平均猝灭常数分别为Ks=3.87×103L/mol和Ks=3.20×103L/mol。

3 结论

实验结果表明,纳米TiO2与Mb之间有很强的结合作用，它们之间的作用力主要是静电力和疏水力，使Mb构象发生了变化。其猝灭过程速率常数为：26 ℃时Kq=3.79×1011L/(mol·s)，R=0.988 9；45 ℃时Kq=2.96×1011L/(mol·s)，R=0.988 4；其结合常数：26 ℃时有KA=3.67×103L/mol，R=0.993 5；45 ℃时有KA=2.02×103L/mol，R=0.993 7。其结合位点数约等于1。

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Study on interaction of myoglobin with TiO2nanoparticlesby fluorescence spectroscopy

Huang Heyong1，2, Zhou Jiahong1, Feng Yuying1

(1. Analysis and Testing Center, Nanjing Normal University, Nanjing 210023, China;2. School of Geography Science, Nanjing Normal University, Nanjing 210023, China)

TiO2nanoparticles is synthesized by using the Sol-gel method.The morphology of TiO2nanoparticles are characterized by the transmission electron microscopy(TEM).The interaction between TiO2and myoglobin (Mb) is studied by using the fluorescence spectroscopic method.TiO2effectively quenches the intrinsic fluorescence of Mb via static quenching.The process of binding TiO2on Mb is a spontaneous molecular interaction procedure. According to thermodynamic parameters,ΔHand ΔS, it is indicated that the hydrophobic and electrostatic interactions can play a major role in stabilizing the TiO2-Mb complex.

TiO2nanoparticles; myoglobin; fluorescence spectroscopy; interaction

2014- 09- 10 修改日期：2014- 11- 26

国家自然科学基金项目(20603018);江苏省科技发展计划(BM2007132)资助项目

黄鹤勇(1986—)，男，江苏南通，硕士，实验师，研究方向为光谱和色谱.

E-mail：huangheyong@njnu.edu.cn

TB383

A

1002-4956(2015)5- 0071- 04