牛乳腺上皮细胞体外培养条件的优化及功能验证

贺小英 马利兵 程腾 刘希宇 刘销 吴飞

摘要：乳腺上皮细胞是研究泌乳的调控机理、乳腺癌发病机制以及制备乳腺生物反应器靶细胞。由于乳腺细胞体外培养生命周期较短并且增殖活力与体外培养时间呈负相关，到目前为止，能够适合体外研究的乳腺细胞系报道较少。因此，在优化了乳腺细胞体外培养条件的基础上，进一步验证了优化体系后培养的乳腺上皮细胞生物学的稳定性、蛋白表达情况及转基因的效率。结果表明：1：1DMEM/F12基础培养液+10%胎牛血清+2mmol/L谷氨酰胺+10ng/mL表皮生长因子+10ng/mL碱性成纤维细胞生长因子+10μg/mL的ITS+5μg/mL胰岛素+0.1mmol/L非必须氨基酸是维持乳腺上皮细胞体外培养的最适条件。在此培养条件获得的乳腺上皮细胞生长旺盛，传代次数能延长到20代，生长后期仍然能稳定表达CK18，且具有较高的转基因效率.

关键词：乳腺细胞；体外培养；转基因；乳腺生物反应器

中图分类号：Q2-0 文献标识码：A 文章编号：1007-7847（2015）01-0019-05

Optimization of Culture Condition and Functional Verification for Bovine Mammary Epithelial Cells in Vitro

HE Xiao-ying*，MA Li-bing，CHENG Teng，LIU Xi-yu，LIU Juan，WU Fei

（School of Mathematics，Physics and Biological Engineering，Inner Mongolia University of Science and Technology，Baotou 104010，Inner Mongolia，China）

Abstract：Mammary epithelia cells are an important invitro model to study the mechanism of lactation，cancer and mammary bioreactor.However，it is very hard to culture in vitro.Currently，fewer cell lines have been used in mammary research field.A valid method for the study of the mammary gland epithelium cell was established.The results showed that the media added 1：1 DMEM/F12，plus 10% FBS，2 mmol/L L-glu-tamine，10ng/mL EGF，10ng/mL FGF，10（xg/mL ITS，5μg/mL insulin and 0.1 mmol/L NAEE was the suitable media for bovine mammary epithelial cells.The mammary epithelia cells obtained under optimized condition grew vigorous，extended life span to 20 passages，steadily expressed CK18 and had high transgenic efficiency.

Keywords：mammarycells；invitroculture；transgene；mammarybioreactor（LifeScienceResearch，2015，19（1）：019-023）

乳腺细胞是研究泌乳的调控机理、乳腺癌疾病模型、乳腺生物反应器制备转基因动物等领域的靶细胞。到目前为止，由于乳腺上皮细胞是一种高度分化的细胞，体外培养较为困难。尽管现在已经建立了一些永生化的牛乳腺细胞系，但是，这些细胞系除了MAC-T外[1]，其他细胞系还没有得到别的学者检验及进一步的相关研究，而且乳腺上皮细胞体外培养的体系也不完善，当采用外源基因导人体外培养的细胞方法来分析基因功能或转基因动物研究时，要求乳腺上皮细胞能长时间地体外稳定生长。此外，在培养过程中由于培养环境的局限性，影响了细胞的正常生长，进而导致调控细胞凋亡等的信号通路发生改变，加速了细胞的死亡，这样也局限了正常乳腺细胞的体外研究[2]。因此，探索牛乳腺细胞体外培养条件是该领域研究的迫切需要。本研究旨在研究牛乳腺上皮细胞体外分离培养的最适条件，在此基础上，进一步验证优化体系后培养的乳腺上皮细胞生物学稳定性、蛋白表达及转基因的效率高低。

1材料与方法

1.1材料和试剂

新鲜乳腺组织取自屠宰场。质粒纯化试剂盒说明书（EndofreePlasmidExtractionKit）购自Promega公司（美国）；脂质体2000、1：1DMEM/F12基础培养液、非必需氨基（NEAA）、胎牛血清（FBS）、表皮生长因子（EGF）、胰岛素蛋白转铁硒纳（100x）（ITS）和膜岛素（Insulin）购自Invitrogen公司（美国），单克隆鼠抗角蛋白CK18、羊抗小鼠IgG-cy3二抗和DAB显色试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司。Hoechst33342、100U/mL青霉素、100（xg/mL链霉素和谷氨酰胺购自Sigma公司（美国）。真核表达载体pEGFP-Cl购自Clontech公司（美国）；宿主菌DH5a为本室保存。

1.2方法

1.2.1乳腺上皮细胞的分离与培养

无菌状态下取健康牛乳腺组织，采用PBS液清洗3?5遍，用眼科镊剪成1mm3小块，将其贴于培养肌中，间距0.5cm左右，倒置培养皿，置37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱大约2～3h左右。待组织块与培养皿粘合牢固时，补足培养液，每隔3d换一次液持续培养，大约10?14d上皮养细胞迁出。待乳腺上皮细胞达90%汇合后，去除培养液，PBS清洗两遍，加入0.25%胰酶0.04%EDTA消化8min，待胞质回缩变圆，加入等量的含有血清的基础培养液终止消化，收集细胞悬液，800r/min离心5min，弃上清，加入培养液制成细胞悬液，按1：3的比例接种在新的培养皿中，37℃，5%CO2，饱和湿度下继续培养。

1.2.2不同培养条件对乳腺上皮细胞生长的影响

根据表1配制8种不同的细胞培养液。将纯化的乳腺上皮细胞分成两组，以每mL1x104个接种于12孔培养板，第一组培养6d后，消化细胞进行计数，按Patterson公式计算群体倍增时间T（T=tlg2/（lg/N0- lg/N1）；（N0：对数生长期末回收细胞数；N1：对数生长期细胞数对数期培养的时间）。第二组进行持续传代培养，统计在8种不同培养条件下细胞的最终传代次数。通过细胞生长群体倍增时间和最终存活的代数评估8种不同培养条件下的培养液对乳腺上皮细胞生长的影响，最终确定乳腺上皮细胞的最佳培养条件。

1.2.3优化条件下乳腺上皮细胞的生物学特性检测情况检测

首先无菌状态下取健康牛乳腺组织，采用组织块贴壁法，乳腺组织贴壁培养过程，部分组织会直接迁出乳腺细胞，显微镜下观察，取出只迁乳腺细胞的组织块，转移到新的培养皿，以1.2.2组确定的最适培养条件培养乳腺上皮细胞，显微镜下观察其生物学特性。

1.2.4优化条件下乳腺上皮细胞的标记蛋白表达

以1.2.2组确定的最适培养条件组获得的上皮细胞为研究对象，选取第15代细胞，以1x105个细胞接种到载玻片，待细胞在载玻片汇合生长后，PBS清洗，用4%多聚甲醛固定细胞20min，然后用封闭液封闭2h，缓冲液洗涤3遍，填加1：50的鼠抗人CK18，4℃过夜，缓冲液洗涤3遍，加1：100Cy3荧光标记的羊抗鼠二抗，室温暗室1h，用1：500的Hoechst33342避光染核15min，镜检。

1.2.5优化条件下pEGFP-Cl鉴定乳腺上皮细胞转染效率

严格按照质粒纯化试剂盒说明书操作，纯化真核表达载体pEGFP-Cl，利用紫外分光光度计检测浓度为548 比值为1.86。

在上述研究的基础上，选取细胞体外增殖活力较好且存活时间较长的两组为研究对象，分别选取体外培养的第10代细胞，待乳腺上皮细胞汇合生长至75%～85%时，按脂质体2000操作说明书进行转染，DNA与脂质体的转染比例是1：2|31，转染48h后通过荧光显微镜检测转染效率。

2结果

2.1不同体外培养条件对乳腺上皮细胞生长的影响

根据群体倍增时间和最终传代次数综合判断两组乳腺上皮细胞，结果表明，这7种培养液均能维持一定时间的牛乳腺上皮细胞体外生长，且在早期细胞生长活力差异不显著，在血清浓度10%的条件，单一生长因素对乳腺细胞的群体倍增时间较长，传代次数均较低（R1M2M3和R4）。15%的高血清浓度可延长细胞体外寿命，但是群体倍增时间较长（R7）：5%低血清浓度其群体倍增时间最长，细胞存活时间最低（H8），H5组的群体倍增时间为34.45，细胞生长活力较好，细胞能稳定存活20代左右，为最适生长条件。

2.2优化培养后的乳腺上皮细胞细胞生物学特征

如图1所示，采用R5组培养体系培养乳腺组织，大约7～10d后，部分组织块会直接迁出乳腺上皮细胞（图1A），原代细胞以单层汇合生长，细胞生长旺盛，大多以类“肌细胞”样生长（图1B），随着传代次数的增加会形成两种不同细胞群，即开放型和闭合型细胞群开放型细胞群，边界不清，大多以类“肌细胞”样生长；闭合型细胞群，细胞连接紧密，细胞以典型的“铺路石”样聚集生长（图1C）。随着传代次数的增加，乳腺细胞会形成空泡状结构（图1D箭头所示）；采用R5组培养的乳腺上皮细胞生长到18代以后，明显衰老，细胞体积变大、呈平铺状、折光性差（图1E）通常乳腺细胞形成单克隆的效率较低，但是优化培养条件后原代分离培养的乳腺细胞单隆生长状态良好（图1F箭头所示）。

2.3优化后乳腺上皮细胞的免疫荧光结果

常规配方的培养条件下，体外培养的乳腺细胞15代大量死亡，细胞呈平铺状，无法检测蛋白表达情况。采用优化条件下培养的第15代乳腺上皮细胞，免疫荧光检测角蛋白CK18在牛乳腺上皮细胞的胞浆中能够稳定表达（图2）。

2.4pEGFP-Cl转染乳腺上皮细胞转染效率鉴定

乳腺上皮细胞的生长状态直接决定细胞的转染效率，选取上述结果中细胞体外增殖活力较好且存活时间较长的R5和R7组为研究对象，结果表明：采用R5组培养条件下获得的细胞转染效率较R7组高（图3）。

3讨论

3.1 乳腺细胞体外培养条件优化

乳腺细胞能否在体外维持稳定生长是转基因及阳性克隆筛选的的关键，目前，已经证实一些促细胞分裂剂会促进乳腺上皮细胞的增殖：如EGF、胰岛素、bFGF、HGFJGF-I.TGF-β、胎牛血清、乳腺提取物等都可以刺激乳腺上皮细胞的增殖'胰岛素是细胞周期的主要外源性调节因子，它和胰岛素样生长因子、EGF等一样，能促使细胞由G1期进入S期，促进细胞分裂增殖[5]。：EGF和bFGF有很强的促细胞分裂活性和促生长作用[6、7].

本研究通过群体倍增时间和不同培养条件下细胞的传代次数检测不同培养液对hMGEs体外生命的维持[8]。结果表明1：1DMEM/F12基础培养液+10%胎牛血清+2mmol/L谷氨酰胺+10ng/mL表皮生长因子+10ng/mL碱性成纤维细胞生长因子+10μg/mL的ITS+5μg/mL胰岛素+0.1mmol/L非必须氨基酸是维持乳腺上皮细胞体外培养的最适条件。利用此条件培养的乳腺上皮细胞形态良好，活力旺盛，能够维持20代左右的生长活力。此外，我们发现EGF与bFGK混合添加不仅促进乳腺匕皮细胞的增殖还能延长细胞的寿命。

3.2优化条件下培养的乳腺上皮细胞特征分析细胞生长状态的好坏直接决定了体外研究结果的真实性和可靠性。因此，本研究在优化了乳腺上皮细胞体外培养条件的基础上，进一步检测了此条件下培养的乳腺细胞生物学的稳定性、蛋白表达情况及转基因的效率。通常培养条件下，组织块迁移的时间大约需要10?14d，采用优化条件后获得乳腺上皮细胞时间7～10d，缩短了周期，优化后的乳腺上皮细胞的生长状态旺盛，细胞生物学特征稳定，且单克隆形成的效率较高。常规配方的培养条件下，体外培养的乳腺细胞15代大量死亡，细胞呈平铺状，无法检测蛋n表达情况但是采用优化条件下培养的第15代乳腺上皮细胞仍能稳定表达上皮细胞的标记蛋hCK18进一步验证其转基因的效率高低，结果表明采用体外培养条件下优化后获得的乳腺上皮细胞第10代做基因转导具有较高的转染效率。

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