睾丸间质细胞在小鼠生精恢复过程中的作用

袁丽芳 安娜 王善林 关淑鸾 王峰 李宗悦 朱宝长

摘要：研究睾丸间质细胞对小鼠生精恢复过程的作用，可以为深入理解睾丸精原干细胞与其微环境（体）细胞间的相互关系提供实验证据选取8周龄健康C57近交系成年雄性小鼠60只，腹腔注射22mg/kg白消安建立小鼠精子发生受阻模型，随机分成1，2--甲磺酸乙烷（ethanel，2-dimethanesulphonate，EDS）处理组、氟他胺处理组和对照组，每组20只，3d后分别给予EDS腹腔注射（100mg/kg）、氟他胺埋植，对照组仅注射溶剂、埋植空管，分别在处理后的1个月内每周采样，Real-time RT-PCR检测CSF1.Gdnf、PLZF和Nanog mRNA表达水平，Gdnf蛋白水平表达，并在4周时进行睾丸组织HE染色，观察组织学变化并对相关指标进行量化分析结果表明，小鼠睾丸间质细胞去除及雄激素受体阻断均能促进睾丸损伤后的生精恢复过程，但是，受体阻断的效果更强，说明间质细胞除了通过雄激素发挥作用外还直接对生精恢复起着一定的促进作用，这种促进作用可能是通过分泌CSF1等细胞因子来实现的。

关键词：间质细胞；生精恢复；小鼠；睾丸

中图分类号：Q28 文献标识码：A文章编号：1007-7847（2015）01-0006-07

The Role of Leydig Cell for Restoration of Spermatogenesis in Testis of mice

YUANLi-fang1，2，AN Na2，WANG Shan-lin2，GUAN Shu-luan2，WANG Feng2，LI Zong-yue2，ZHU Bao-chang，

（1.College of Mathematics and Computer Science，Shangrao Normal University，Shangrao 334000，Jiangxi，Chian；2.College of Life Science，Capital Normal University，Beijng 100048，Chian）

Abstract：To study the role of Leydig cells inrestoration of spermatogenesis in testis of mice，we compared reestablishment of spermatogenesis in testes with ablation of Leydig cells and blockage of androgen receptors for understanding relationship between spermatogonial stem cells and their microenvironment.Total numbers of 60 male mice（C57）were selected at age of 8 weeks old.Spermatogenesis disruption model was made by intraperitoneal injection with busulfan（22mg/kgBW（body weight））.Then they were randomly divided into 3 groups.Treatments of EDS group（n=20），flutamide group（n=20）and the control group（n=20）were received intraperitoneal in jection of ethane 1，2-dimethanesulphonate（EDS）（100mg/kg BW），flutamide implantation and viechle solution，respectively.The expression of CSF1，Gdnf，PLZF and Nanog mRNA were measured by Real-time RT-PCR at 4 weeks after treatment.In addition，the protein expression of GDNF was assayed by Western blot.The histological changes in testicular tissue were observed under microscope with HE staining at 4 weeks.Although both removal of Leydig cells and blockage of androgen receptors could promote restoration of spermatogenesis in testis of mice，we found that androgen receptor blockage gave rise to a stronger effect.

在生理条件下，睾酮对于成年动物的精子发生是不可或缺的，然而Ogawa和Dohrinski等在精原干细胞移植研究中相继表明[1]，使用GnRH激动剂抑制受体动物睾酮后能显著增加精原干细胞移植后的克隆形成效率，进而证实促进精原干细胞克隆率就是通过抑制睾酮与受体结合来实现的，因此，不论何种方法只要抑制了睾酮的作用就能表现出这种促进作用（包括GnRH激动剂、受体拮抗剂等），其作用机理至今仍不完全明了。睾丸间质细胞（Leydig cells，LCs）仅占睾丸细胞总数的2%～4%，却是雄性睾丸内所有雄激素的唯一来源。然而，睾酮是通过受体来发挥作用的，研究发现睾酮受体仅存在于睾丸体细胞（包括支持细胞、赖氏细胞和管周膜细胞等）上，生殖细胞本身并没有睾酮受体，也就是说，睾酮并不直接作用于生殖细胞，而是通过睾丸体细胞对生殖细胞施加影响的。有研究表明Sertoli细胞可以通过分泌某些细胞因子（如GDNF、SCF、ERM等）影响精原干细胞的增殖[2]，然而，其他睾丸细胞也对精子发生具有一定的贡献，如赖氏细胞除了分泌睾酮外也能够分泌CSF1来影响精原干细胞[3]，但是，LCs在精子发生受损后的恢复过程中是否发挥作用却仍然不清楚。本研究通过对比去除LCs与阻断雄激素的区别来推测睾丸LCs缺失在精子发生恢复过程中是否具有雄激素以外的其他作用，为深入理解睾丸精原干细胞与其微环境（体）细胞间的相互关系提供实验证据。

1材料与方法

1.1实验动物

购自军事医学科学院品系为C57近交系成年健康雄性小鼠，饲养在本校动物中心的屏障环境内，自由饮食，环境温度为22～26℃，人工光照周期为12L：12D自动控制。

1.2主要试剂

白消安（busulfan）、DMS0、MTT及氟他胺（flutamide）（美国Sigma公司），Trizol及RT-PCR试剂盒（德国TianGen公司），SYBR Green Assay 试剂盒（日本TaKaRa公司），引物由上海Invitrogen公司设计合成，Gdnf抗体（美国Santa公司），一抗β-Actin（鼠源，中杉公司），EDS由本实验室合成。

1.3小鼠睾丸损伤模型

8周龄雄性C57小鼠60只，25～32g，以溶剂比例（DMS0：水=1：1配制成）4.4mg/mL的溶液，按22mg/kg体重分别给60只小鼠腹腔注射后，随机分成EDS处理组、氟他胺处理组和对照组3组，每组20只。

1.4小鼠LCs去除和氟他胺埋植

EDS处理组在白消安注射3d后腹腔注射100mg/kgEDS，配制方法为称取200mgEDS粉末，溶于DMS0：水=1：3的10mL溶液中；氟他胺组小鼠颈部皮下埋植两头开口5mm长的硅胶管，管内填满氟他胺粉末。

1.5 睾丸组织形态学观察

EDS和氟他胺处理4周后，处死小鼠，取睾丸，放人苦味酸（Bouin液）中间定15h，常规制备石蜡切片，HE染色，于光学显微镜下观察睾丸组织形态学切片。统计曲细精管直径（seminifemus tubule diameter）、生精上皮厚度（the thickness of seminiferous epithelium），成型精子头部数（sperm head number）及空泡率（vacuoles rate）等组织形态学指标，每组中每项指标至少统计10个切片，100个曲细精管。不规则圆形曲细精管取最小直径值，生精上皮厚度取垂直和水平方向4个生精上皮厚度的平均值，空泡率=产生空泡的曲细精管个数/总曲细精管数X100%。

1.6 Real-time RT-PCR检测睾丸组织PLZF、 Gdnf、Nanog、CSF1、mRNA表达

采用Trizol-氯仿抽提总RNA，各组RNA样本260nm与280nm吸光度（A）值的比值A260/A280）均>1.8，符合PCR试验要求。按RT-PCR试剂盒说明书合成cDNA，加入SYBR Green Assay，反转录混合体系建立完成后，混匀，进行下一步Real time RT-PCR检测，本实验用的是Bio-RAD Real-time RT-PCR仪，mRNA水平用L19作内对照标化。基因表达通过各组Ct值间对照组Ct值间的比值做相对定量分析各基因的引物及其碱基序列如表1所示。

1.7 MTT法探究不同浓度EDS对Helas细胞的损伤

取对数生长期的Helas细胞，以1X105/mL的密度接种于96孔板，培养箱培养24h后加入终浓度为0.1mg/mL、1mg/mL、10mg/mL、100mg/mL、1000mg/mL直至饱和浓度的EDS，每组6个复孔继续培养24h后于倒置显微镜下观察细胞形态变化，每孔弃旧液培养，并加入20μL、5g/L的MTT原液和180μL无血清培养基，放入培养箱继续培养，4h后弃去培养液并加入150DMSO，待沉淀溶解酶标仪测定570nm波长的吸光度值。

1.8 Western-Blot检测睾丸组织Gdnf的蛋白表达

TRIzol法提取蛋白质，Bradford法测定7d、14d、21d、28d、35d的对照组、EDS组和氟他胺组共15个蛋白样的蛋白浓度，配制12%的分离胶及5%浓缩胶，运用Bio-RAD的标准电泳装置电泳后转至PVDF膜，1gBSA加上20μLPBST室温封闭1h，1：1000—抗4℃孵育过夜，TBST洗涤3次，1：2000二抗室温孵育2h，TBST洗涤3次，将膜取出加显影液A、B，按照0.5mLA，0.5niLB，4mL水的配制方法，按操作程序进行曝光处理，曝光时间为2～5S。用GAPDH进行蛋白检测：条带进行图像分析，测定灰度值，用β-Actin作内参来比较各组Gdnf的相对表达差异。

1.9 统计学分析

实验结果用SPSS17.0统计软件进行分析，所有数据以表示，组间两两比较采用T显著性检验；显著性差异，与对照组相比较，a：P<0.01，b：P<0.05；与EDS组比，c：P<0.01，d：P<0.05。

2 结果

使用白消安（22mg/kgBW）处理成年小鼠可以部分地去除睾丸内的精原干细胞，使睾丸精子发生受阻，表现为睾丸质量下降，曲细精管直径、曲细精管上皮厚度、精子数目显著下降，生精上皮空泡率上升，但是之后将逐渐恢复，本研究将白消安处理后的小鼠随机分为3组，分别使用EDS、flutamide和载体溶剂处理，采样观察睾丸组织学变化和组织内不同细胞因子的变化。

2.1 小鼠睾丸组织曲细精管直径、生精上皮厚度、成型精子头部数及空泡率比较

EDS及氟他胺处理4周后，EDS和氟他胺处理组睾丸曲细精管直径、生精上皮厚度、成型精子头部数均显著大于对照组（P<0.01），而空泡率则显著低于对照组（P<0.01）。但是，EDS和氟他胺组间差异不显著（见表2），说明使用EDS去除赖氏细胞与使用氟他胺阻断雄激素受体在曲细精管中精子发生恢复中所起到的作用基本相似。此外，通过睾丸组织学切片观察发现，EDS及氟他胺处理4周后，EDS（图1C、G）及氟他胺（图1D、H）处理组曲细精管内各级生精细胞排列紧密，生精上皮厚度正常，管腔内可见大量成熟精子，提示此时小鼠精子发生恢复程度较高，而对照组曲细精管空泡率明显，生精上皮厚度变薄，管腔内成熟精子较少。说明使用EDS去除赖氏细胞与使用氟他胺阻断雄激素受体都能促进睾丸损伤小鼠的生精恢复。

2.2 小鼠睾丸组织中Gdnf、Nanog、PLZFmRNA表达情况

EDS及氟他胺处理4周后，Real-timeRT-PCR结果显示，EDS和氟他胺处理组睾丸组织中Gdnf，Nanog、PLZF mRNA的表达量均显著高于对照组（图2），Gdnf是由Sertoli细胞分泌的细胞因子，它能够通过受体作用于睾丸精原干细胞，促进后者的自我更新，从而促进睾丸精子发生恢复。本实验在处理后4周不仅发现EDS和氟他胺组均显著高于对照组，而且发现氟他胺组显著高于EDS组，尤其是PLZF的表达在氟他胺组的水平近4倍于EDS组，由于氟他胺的使用仅在睾酮受体水平阻碍其作用，并不影响LCs的其他功能，而EDS的使用则因为诱导赖氏细胞凋亡而表现为既导致雄激素水平下降又影响赖氏细胞的功能（包括其可能的细胞因子分泌），故推测EDS组与氟他胺组之间的差异主要体现在赖氏细胞的功能上，EDS处理除了阻断睾酮的作用外还可能同时阻断了其他对精原干细胞有促进作用的因子。Nanog与PLZF都是由精原干细胞来源的细胞因子，两者在睾丸中的表达量与对照组相比都有显著的增加，且表现为氟他胺组高于EDS组，说明抑制睾酮可以显著刺激精原干细胞的增殖，而且仅抑制睾酮比仅抑制睾酮又同时去除赖氏细胞的效果更好。考虑到睾酮受体仅在体细胞分布，而Gdnf来源于Sertoli细胞的情况，对比各处理组Gdnf的表达趋势，提示抑制睾酮对生精恢复的作用可能是通过Gdnf来实现的。

2.3 小鼠睾丸组织CSF1在处理后时间mRNA表达情况

KDS及氟他胺处理后1月内每周采样，Real-timeKT-PCR结果显示，EDS处理组睾丸组织CSF1 mRNA的表达量均低于对照组（1w、2w、3wP<0.01，4wP<0.05）；氟他胺与对照相比差异不大（见图3），EDS导致赖氏细胞凋亡，但是，一个月后则逐渐恢复，此处虽然EDS处理引起了细胞凋亡，但是由赖氏细胞分泌的CSF1的表达在处理后一周下降最为明显，之后逐渐恢复，与赖氏细胞的变化趋势相似，这表明CSF1表达与赖氏细胞的存在数量基本一致。

2.4 Western-blot检测睾丸组织Gdnf的蛋白表达情况

Gdnf的蛋白表达量在处理后21?35d，EDS和氟他胺组均显著高于对照组（P<0.01）（图4），也验证了两种处理方式降低睾酮均能促进精子发生的恢复，EDS组与氟他胺组比较，氟他胺组显著高于EDS组（21d，P<0.01；28d，P<0.01），说明去除赖氏细胞抑制睾酮后蛋白表达不如仅抑制睾酮的蛋白表达高，这与4w时，mRNA表达趋势相符，也进一步说明赖氏细胞对生精恢复有贡献。

2.5 MTT法探究不同浓度EDS对Helas细胞的损伤作用

为了探究EDS是否存在某种非特异性作用，本研究特使用体外培养的Helas细胞作为对象，将本实验小鼠腹腔注射EDS浓度（100mg/kg）换算为整体循环浓度为0.1mg/mL，并以此为起始浓度，浓梯度为0.1、1、10、100、1000mg/mL增加直至EDS的饱和浓度（10000mg/mL），以相对细胞增殖数代表细胞存活率，结果表明，10mg/mL及以下EDS浓度Helas细胞存活率与对照相比差异不大，高于1000mg/mL的EDS浓度开始对细胞增殖有明显的抑制作用（见图5），这说明低浓度的EDS并未出现非特异性细胞毒性，也表明本实验所使用的EDS浓度是安全的。

3 讨论

睾丸曲细精管由Sertoli细胞与发育状态不同的生殖细胞组成，Sertoli细胞不仅为生殖细胞提供发育所需的营养物质与适当环境，同时也通过分泌细胞因子对生殖细胞的发育进行调控，LCs是曲细精管间质中分泌睾酮最重要的内分泌细胞，它对于雄性的生育能力及第二性征的维持至关重要。在精原干细胞移植研究中，人们发现抑制睾酮能够提高精原干细胞移植后的成功率[1]，后来发现该作用是通过睾酮受体发挥作用的[4]；此外，在睾丸生精过程受损后的恢复过程中，抑制睾酮同样有利于精子发生的恢复[5]。

此后还有人发现睾丸中除了Sertoli细胞外，赖氏细胞也对精子发生具有重要的作用，然而并未有明确的证据显示赖氏细胞是如何参与精子发生恢复的。本研究通过实验对EDS组和氟他胺组进行比较研究，从而阐明抑制睾酮，间质细胞对于受损精子的恢复具有的重要作用。

本实验结果显示，不同处理后4周采样，分别研究Nanog与PLZF基因的表达量，以期代表精原干细胞的恢复状态，可以看到Nanog的表达量与Gdnf基本相似（图2），但是，因为没有进行免疫组化标记，尚不能看出二者的显著区别：而PLZF和Nanog在氟他胺组的表达显著地高于EDS组，说明KDS组的促进作用不如氟他胺组，与我们的假说基本吻合，因此推测，在受损睾丸生精恢复过程中LCs具有除了雄激素以外的贡献，Gdnf的蛋白表达情况也验证了这一点。Gdnf是由Sertoli细胞分泌的细胞因子，它能够通过其受体而作用于精原干细胞，促进其自我更新，因而参与精子发生的重建过程，氟他胺和EDS处理都能够使Sertoli细胞表达Gdnf的能力增强，但是氟他胺处理组的作用更强，也说明本研究在组织学水平观察到氟他胺和EDS处理对睾丸受损后恢复的刺激作用都有可能是通过影响Serlnli细胞分泌Gdnf，进而刺激精原干细胞增殖来实现的，尽管还不能完全排除其他机制的参与，如刺激精原干细胞各阶段的分化过程。

虽然用EDS去除赖氏细胞和用氟他胺阻断受体都能够达到阻止睾酮作用的目的，表现对睾丸精子恢复具有一定促进作用，但是，前者在去除赖氏细胞的同时也将赖氏细胞可能的其他分泌物也一同去除了，而后者在不干扰睾酮水平的情况下仅仅阻断了睾酮通过受体的作用途径。如果赖氏细胞分泌的细胞因子在生精过程恢复中具有一定的作用，那么，在EDS组中就应该表现为促进作用的抵消或减弱，否则就表明LCs没有雄激素以外明显的作用，从Nonog、PLZF、GDNF及CSF1表达等方面观察，本研究结果都显示F.DS组低于氟他胺组的现象，故表明LCs在此发挥着雄激素以外的作用。CSF1是目前已知由赖氏细胞分泌的细胞因子[6]，其主要作用是促进精原干细胞的增殖，在本实验中CSF1的表达随着EDS所诱导的赖氏细胞凋亡而急剧下降，随后有逐步升高的趋势，这种模式与前人报道基本一致，但是，CSF1的降低并未在受损睾丸精子发生恢复过程中的组织学指标里表现出来（表2），可能存在两方面的原因：第一，可能是由于组织学检验的灵敏度相对较低，从而导致没有甄别出；第二，可能是抑制睾酮所出现的促进生精恢复的作用是通过其他途径起作用的。本研究组织学采样点仅设在处理后4周，其他时间点则不得而知，LC除了CSF1以外的功能尚不清楚，还需要进一步深入研究才能最终理解其作用。

EDS是一种睾丸间质细胞特异性凋亡诱导剂，能杀死睾丸LCs。不少研究者对其特性进行了研究，结果表明对大鼠一次性腹腔注射KI）S（75mg/kg）3d后，LCs开始调亡，1周后体内睾酮降至最低，8周后恢复注射前水平[7、8]，同样，还有研究证明了EDS对小鼠也有类似的作用，但其效果不如大鼠敏感[9]，为保障去除LCs的有效性，实验证明所采用的剂量（100mg/kg EDS）高于大鼠的常用剂量。另外，既然CSF1是间质细胞表达的，那么EDS处理后，CSF1mRNA表达量应与间质细胞数量保持一致，本试验中CSF1mRNA的表达量均低于对照组（1w、2w、3wP<0.01，4wr<0.05），氟他胺与对照相比差异不大，说明这个浓度的EDS对于去除小鼠LCs是有效的

为了进一步验证EDS本身是否对小鼠除赖氏细胞外的其他细胞造成毒性或损伤，本研究通过MTT法将不同浓度的KDS作用于体外培养的Helas细胞，结果发现本实验浓度的EDS并未出现非特异性细胞抑制作用，而高于本实验百倍以上的浓度才开始显示出Helas细胞的存活率的下降趋势。因此，排除了本实验中EDS本身的毒性对其他细胞作用的可能性。

目前精原干细胞的表面标志并未在业界达成一致，其中，PIZF是转录抑制因子P0Z家族成员之一，仅在早期未分化的精原细胞中表达，是精原干细胞自我更新的必需因子[10]，常用于精原干细胞的富集和纯化Nanog是在干细胞表达的另一个基因[11]，有报道称Nanog仅在表达PLZF的部分精原干细胞中表达[12]，提示在标记精原干细胞方面Nanog的特异性更强，但是本实验并未观察到更有意义的区别。

白消安是一种烷化剂，能够在体内非特异性地消除干细胞，包括生殖干细胞，临床上常用于肿瘤治疗，而在治疗过程中常伴随着生育力的下降[13]。因此，本研究在实践中对于恢复精子发生的临床治疗具有一定的参考价值，同时，为在理论上重新认识干细胞与微环境（niche）的关系也提供了新的思路。精原干细胞的增殖受到其微环境的精确调控，虽然niche的组成目前还不完全清楚，有人认为niche就应该是与精原干细胞直接接触的Sertoli细胞，也有人认为niche应该包括所有对其调控行影响的细胞，而本研究发现赖氏细胞也对niche有一定的贡献，提示人们在认识niche的过程中位该将眼光放得更宽些，也可能它比人们想象中的更复杂，而这一问题的解决可能对研究各种干细胞niche间关系都有着积极的生物学意义

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