甘蔗优良DSE促生菌株的筛选及田间接种效果

覃丽萍 苏琴 张雯龙 谢玲 农倩 张艳 陈艳露

摘  要  深色有隔内生真菌（DSE）是一类与植物互惠共生的内生真菌，研究DSE对甘蔗苗生长的影响，为探索其在甘蔗生产节肥减耗和保护蔗地生态系统中的应用提供理论依据。通过DSE与甘蔗组培苗的室内共生试验进行初步筛选，然后采用5×105 cfu/mL菌液淋根的方法在室内盆栽条件下进行复筛，再选用潜力菌株在田间测试其对甘蔗生长的影响，以期筛选出对甘蔗具有明显促生效果的DSE菌株。结果表明：在盆栽条件下所有DSE菌株（组合）接种甘蔗后甘蔗的株高、总鲜重、地上部干重和总干重与对照相比均有不同程度的提高，提高范围分别在11.4%～30.9%、7.5%～65.3%、5.3%～58.0%和6.0%～64.7%;9个菌株（组合）接种甘蔗后甘蔗的地下部干重比对照增加了0.7%～103.6%不等;在田间试验中，8个菌株（组合）中有7个接种甘蔗后甘蔗的总鲜重比对照提高了2.0%～50.1%，其中的3个菌株处理使甘蔗的株高提高了6.9%～10.0%。表明DSE真菌对提高甘蔗的生产能力和保护蔗地的生态环境具有较好的开发利用潜力。

关键词  深色有隔内生真菌（DSE）;甘蔗;促生

中图分类号  S566.1          文献标识码  A

Selection of Excellent Sugarcane Growth-promoting DSE

Strains and Their Inoculation Effects in Fields

QIN Liping1，2， SU Qin1， ZHANG Wenlong1，2， XIE Ling1，2*，

NONG Qian1，2， ZHANG Yan1， CHEN Yanlu1

1 Microbiology Research Institute，Guangxi Academy of Agricultural Sciences，Nanning，Guangxi 530007，China

2 Guangxi Crop Genetic Improvement And Biotechnology Laboratory，Nanning，Guangxi 530007，China

Abstract  Dark septate endophytes（DSE）is a group of plant symbiotic fungi. The effects of DSE fungi on sugarcane seedling growth were evaluated to provide a reference for the application of DSE on the energy saving in sugarcane production and the conservation of sugarcane filed ecosystem. Based on initial screening by symbiotic culture of DSE and sugarcane in petri dishs， the effects of inoculation of DSE fungi on sugarcane were carried out in pot tests and in fields by pouring root with 5×105 cfu/mL mycelial suspension. It was found that the sugarcane plant height， fresh weight， shoot dry weight and biomass was increased 11.4%～30.9%， 7.5%～65.3%， 5.3%～58.0% and 6.0%～64.7% after inoculation with different DSE strains （combined strains） in pot tests，  and the root biomass of 9 treatments （combined strains） increased 0.7%～103.6%， relative to the control. In field tests， the fresh weight of 7 treatments （combined strains） increased by 2.0%～50.1%， and the plant height of 3 treatments increased by 6.9%～10.0% compared to the control. It suggests that DSE fungi have a practical application value on raising sugarcane production capacity and the conservation of sugarcane filed ecosystem.

Key words  Dark Septate Endophytes;Sugarcane;Growth-promoting

doi  10.3969/j.issn.1000-2561.2015.10.023

甘蔗（Saccharum officinarum）是中国最主要的糖料作物，在农业经济中具有重要地位。广西是中国最大的甘蔗产区，种植面积和蔗糖产品居全国首位。然而由于广西地处丘陵地带，蔗作区主要是赤红壤，土壤肥力差，主要依靠大量施用化肥来保证产量，不但种植成本高，缺乏市场竞争力，还使土壤理化性状和生态环境逐渐恶化[1-2]。因此，利用自然生态系统中共生微生物的促生潜能，改善蔗作区生态环境，促进甘蔗生长，减少化肥的施用量，对保护环境、农业的可持续发展具有重要意义。

深色有隔内生真菌（dark septate endophytes， DSE）是植物共生真菌的典型代表之一，泛指一类定殖于健康植物体内而对宿主无致病性的真菌。对DSE的研究始于20世纪，研究内容主要有DSE的多样性、分类学、地理分布和生态学功能等，已研究过的DSE宿主植物有数百种。在中国，DSE的研究历史仅有十来年，研究非常少且不够深入，主要是对一些中草药（如三七、沙冬青、雪莲、枸杞）、红树及重金属矿区、荒漠地区植被中DSE的分布和定殖情况进行调查研究[3-9]。

目前DSE的研究尚处于初始阶段，有很多问题还不清楚，关于其潜在的生态学功能就有多种观点，但越来越多的研究结果表明，DSE能够与宿主建立互惠共生的关系，提高植物性能。将DSE接种于玉米、水稻、甜高粱等禾本科作物后，对宿主的生长具有促进作用[8，10-12]，甘蔗作为禾本科作物中重要的一员，DSE极有可能也定殖其中并促进其生长。为此笔者对一些DSE菌株进行了一系列的筛选试验，以期找到对甘蔗具显著促生作用的DSE菌株，探索出有效、可行的田间接种方法，为今后菌剂的开发应用奠定基础。

1  材料与方法

1.1  材料

1.1.1  供试甘蔗   室内平皿试验品种为桂糖28号，盆栽试验、田间试验品种为桂糖32号。

1.1.2  供试菌株   供试菌株由本课题组从广西甘蔗根围、大石围天坑群植被根围分离获得或从国外引进，并已确定为DSE真菌。

1.1.3  供试培养基   CMMY培养基：麦芽汁琼脂10 g，玉米粉琼脂8.5 g，酵母粉2 g，琼脂粉7.5 g，蒸馏水1 000 mL ，自然pH值;燕麦培养基：MgSO4·7H2O 1 g，KH2PO4 1.5 g，NaNO3 1 g，燕麦粉10 g，琼脂粉7.5 g，蒸馏水1 000 mL，自然pH值;PDB培养基：新鲜马铃薯200 g，葡萄糖15 g，蒸馏水1 000 mL，pH 6.0。

1.2  方法

1.2.1  平皿筛选   将供试菌株接种于燕麦培养基上，每皿接3个菌块，培养10～15 d待菌落长大后备用。选择长势基本一致的甘蔗组培苗移栽至菌落上，根系平铺于菌落表面，每个菌落上移栽1株苗，每皿栽3株，放入塑料组培瓶中，于25 ℃、光照强度180 μmol/（m2.s2）、光照时间为16 h/d的培养箱中共培养30 d。以未接种DSE的处理为对照，每处理3个重复。

1.2.2  盆栽试验甘蔗的种植   将甘蔗组培苗在营养杯中炼苗，待其长至5～7叶后，选取长势较均匀的植株移栽至高19 cm、直径15 cm的塑料花盆中，每盆种4株，每个处理3个重复。培养基质为稻田土 ∶ 灭菌腐殖质=4 ∶ 3（V/V）。

1.2.3  田间试验甘蔗的种植   将甘蔗组培苗根部洗净并种植于育苗杯中，每杯种1株。育苗基质为泥炭 ∶ 育苗土=1 ∶ 1（m/m），再加1%米糠和1%木屑（于121 ℃间歇灭菌2次，每次30 min）。30 d后将甘蔗苗移植于大田，每处理3个重复，每个重复种10株苗，行距为65 cm，株距为30 cm，四周各设2行保护行。

1.2.4  菌液的制备   将菌株在CMMY平板上培养约10 d，转接于PDB培养基中振荡培养（28 ℃，120 r/min）10～15 d;用灭菌纱布过滤收集菌丝体，用无菌水冲洗数次，将菌丝团打碎，配成5×105 cfu/mL的菌液备用（组合菌株处理：以等量菌液混合配制）。

1.2.5  盆栽试验接种方法   待甘蔗苗移栽10 d后，将菌液淋于其根部，每盆淋200 mL，以淋等量无菌水作为对照。每15 d淋一次，共淋3次。

1.2.6  田间试验接种方法   待甘蔗苗于育苗杯中种植7 d后，将菌液淋于根部，共淋2次，第一次每杯淋5 mL，第二次每杯淋10 mL。将甘蔗苗移栽至大田后，处理4和处理6（处理方法详见表1）再分别淋2次，第一次淋20 mL/株，第二次淋50 mL/株。每次淋菌时间间隔15 d，以淋等量无菌水作为对照。

1.2.7  调查方法   平皿试验中，共培养30 d后将蔗苗根部培养基洗净，置于50 ℃烘箱中烘干，称量干重;盆栽试验中，最后一次淋菌后2 个月取全部植株调查;田间试验中，最后一次淋菌后8 个月调查，每个重复随机取4蔸。调查方法：将根部洗净，于室内晾干水，记录株高，称量鲜重，于50 ℃烘箱中烘干，称量干重。

1.3  数据统计分析   用Excel 2007和DPS6.55数据统计分析软件进行统计分析，采用Duncans新复极差法进行方差分析。

2  结果与分析

2.1  平皿筛选结果

供试的19个菌株中有12个表现出一定的促生能力，甘蔗接种其后干重较对照有所增加，其中以接种3TK4-2-4的增幅最大（101.45%），其次是接种26R-5时增幅达67.4%，与对照相比差异分别达极显著、显著水平。接种其余7个菌株后甘蔗干重较对照的轻，降幅在0.1%～49.9%之间，其中接种G-X-2、TK5-6-6时甘蔗干重与对照相比差异达极显著水平，接种3TK6-2-7时干重与对照相比差异达显著水平（图1）。DSE对甘蔗生长的影响情况见图2。

2.2  盆栽试验结果

接种不同DSE菌株的甘蔗株高均高于对照，增幅在11.4%～30.9%之间，其中接种LTVB3和J2PC4的2个处理与对照的差异达极显著水平（表2），接种L-14、L-1、26R-5+TK2-2-1、J-N3、BPC1、TK2-2-1的处理与对照的差异达显著水平，其余7个处理与对照相比均未达到差异显著水平。

甘蔗接种DSE后各处理的总鲜重均高于对照，增幅在7.5%～65.3%之间，其中以接种TK2-2-1的处理总鲜重最大，并与对照达到差异显著水平，而其他处理与对照的差异均未达到显著水平。

有9个处理的甘蔗地下部干重均高于对照，增幅在0.7%～103.6%之间，其中接种TK2-2-1的处理极大地增加了地下部的干重，比对照增加了103.6%，差异极为显著，其余8个处理与对照相比差异不显著。所有处理的甘蔗地上部干重和总干重均比对照高，增加范围在5.3%～58.0%和6.0%～64.7%之间，接种TK2-2-1的处理与对照达到差异显著水平，其他处理与对照的差异不显著（表2）。DSE在甘蔗根部定殖形成的深色有隔菌丝见图3。

2.3  田间试验结果

2个接种混合菌剂（26R-5+TK2-2-1+TK8-1-5）的处理和接种TK2-2-1 4次的处理甘蔗株高均比对照的稍高，分别增高了7.5%、9.9%和6.9%，但差异不显著。除接种26R-5+TK2-2-1的处理外，其他处理的甘蔗鲜重均比对照的重，增重幅度在2.0%～50.1%之间，其中接种26R-5和接种26R-5+TK2-2-1+TK8-1-5混合菌剂4次的处理与对照相比，差异达显著水平。所有处理的甘蔗有效分蘖数均比对照的多，其中接种26R-5的处理与对照的差异达显著水平。而所有处理甘蔗的糖度与对照相比均无显著差异，说明接种DSE对甘蔗的糖度没有影响（表3）。

3  讨论与结论

所有菌株接种甘蔗后对宿主均无致病性，且在甘蔗根系中可观察到深色有隔菌丝，这是DSE的侵染特征之一，表明这些菌株为DSE真菌。甘蔗苗接种DSE后株高、鲜重、干重都有不同程度的提高，表明DSE能够定殖于甘蔗并与之建立共生体系，促进甘蔗的生长。Newsham[13]统计分析了来自不同国家（地区）的18个独立的DSE平皿接种试验结果，显示接种DSE可提高不同宿主植物的总生物量、地下部生物量及植株N、P含量，本研究的结果与前人的研究结果基本一致。

本研究中同一DSE菌株在不同的接种试验中促生效果有所偏差，可能是由于培养基的养分与土壤的养分不同，从而造成定殖率不同。DSE在宿主植物中的定殖率除与菌株自身有关外，还与储多营养因子（如土壤中的有机质、碱解N和速效K等）有直接关系[14]。培养基中N的形态也影响DSE的促生效果，Newsham[13]和Mmhmoud等[15]发现DSE在以有机N为N源的培养基中促生效果尤佳。DSE几乎没有宿主特异性[16]，而同一种植物不同品种对它的定殖率是否有影响并未见相关报道，因此其促生效果是否与甘蔗品种不同有关尚有待探究。

DSE对包括甘蔗在内的作物的促生效果已有相关研究报道[8，12，17]，但还停留在室内的平皿试验或盆栽试验。本研究经过平皿、盆栽的筛选试验，最后到田间进行初步的应用试验，类似的DSE在作物生产上的应用研究鲜见报道。

综合3个接种试验来看，TK2-2-1和26R-5的促生效果相对比较好且较为稳定，TK2-2-1能显著促进甘蔗地下部生长，26R-5在促进甘蔗分蘖方面比较突出，因此这2个菌株具有良好的能够被开发利用为促生菌的潜能。DSE具有多种潜在的生态学功能[18-21]，稻镰状瓶霉（Harpophora orvzae）对水稻不仅有促进生长的作用，还能增强水稻对稻瘟病的抗病能力[12，22]。TK2-2-1和26R-5能否提高甘蔗的抗病能力还需今后通过测试它们对甘蔗重要病害的生防效果来进一步探讨，这些菌株其他的功能如增强宿主抗旱能力等也将是今后值得关注的焦点。

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