不同亲本细胞质源对甘蔗杂交后代主要性状的影响

罗霆等

摘 要 利用4个不同细胞质源的甘蔗亲本配成正反交组合，在对杂种后代进行SSR-PCR真伪鉴别的基础上，对不同组合后代的不同性状进行t检验和差异性比较。结果表明：这7对正反交组合后代的株高、茎径和有效茎数均差异不显著，仅有一对父母本细胞质源相同的正反交组合后代叶绿素含量差异较大；当以细胞质源为Bandjarmasim Hitam的不同亲本作母本时，子代黑穗病发病率较低，为18.8%和18.9%；当以细胞质源为Badila的崖城58-47作母本时，子代黑穗病发病率较高，为28.8%和28.4%。以细胞质源为Black Cheribon的不同亲本作母本时，其后代真杂种率在91.7%～98.8%之间，而以细胞质源为Bandjarmasim Hitam和Kaludia Boothan作母本时，得到真杂种率低于70%的后代群体。说明虽然甘蔗主要农艺性状的细胞核遗传占主导地位，但是不同细胞质源仍在花粉育性和抗病性等方面发挥作用。本文研究了不同细胞质源的甘蔗亲本与甘蔗主要性状遗传表现的相关性，为甘蔗育种利用优异细胞质源以及进一步从分子水平上研究和发掘甘蔗优异细胞质基因奠定基础。

关键词 甘蔗；细胞质源；正反交；黑穗病；农艺性状

中图分类号 S566.1 文献标识码 A

Abstract Sugarcane varieties with four different cytoplasmic sources were used to combine reciprocal crosses. The characters of various hybrid progenies were analyzed by t test and variance analysis after distinguishing true and false of the hybrid progenies with SSR-PCR. The results showed that， there were not significant difference in height， diameter and number of productive tiller among the 7 pairs of progenies of pros and cons combinations， but the concentration of chlorophyll had a significant difference in only one hybrid progenies from that the cytoplasmic sources of parents was the same. As the female parent containing Bandjarmasim Hitam cytoplasmic source was used to cross， the incidence of smut in offsprings were lower with 18.8% and 18.9% respectively， but when the female parent was YC58-47，containing Badila cytoplasmic source， the incidence of smut in offsprings were highter with 28.8% and 28.4% respectively. The true rate of hybrid progeny with 91.7-98.8% as using the female parent containing Black Cheribon cytoplasm source compared that with less than 70% as the female parent containing Bandjarmasim Hitam and Kaludia Boothan cytoplasmic source. The results suggested that although nuclear genetic was the dominant in the major agronomic traits of sugarcane plant， but cytoplasmic source also play a role in pollen fertility and disease resistance， et al.In this study， the relationship between the parents with different cytoplasmic sources and genetic performance of major agronomic traits in sugarcane was discussed， the result should be provide scientific basic for use of sugarcane breeding with excellent source of cytoplasm， and further researching and exploring of excellent cytoplasm gene on molecular level.

Key words Sugarcane； Cytoplasmic source； Reciprocal crosses； Smut； Agronomic characters

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2015.03.012

现代甘蔗育种的亲本多为热带种原种和少数割手密的后代，少部分含有大茎野生种、中国种或印度种血缘，并且经过甘蔗育种工作者长期的选择，使现有基因库的绝大多数有益基因通过不断的重组聚集到现有甘蔗品种中，育种基因库的遗传总变异缩小，遗传背景狭窄。在近百年的甘蔗育种实践中，由于只考虑核基因的影响而忽略细胞质基因的作用，使目前全世界范围内的甘蔗品种的细胞质源局限在班扎马新黑潭（Bandjarmasin Hitam）、黑车里本（Black Cheribon）、卡路打布廷（Kaludia Boothan）和拔地拉（Badila）这4个热带种原种中[1-3]，一些主要由细胞质基因影响或存在核质互作效应的性状改良一直在甘蔗品种改良中被忽视，在此基础上，甘蔗育种就很难再获得新的突破，造成现代甘蔗栽培品种虽然具有高产高糖等优良特性，但抗病、抗逆等综合抗性下降的问题也日益突出。如中国当前大面积推广的ROC22在生产上感黑穗病严重；ROC16抗旱性差以及绝大多数推广品种在宿根后易感宿根矮化病等[4-5]。因此，发掘利用新的基因资源包括细胞质基因对甘蔗育种意义重大。

细胞质基因是非常重要的基因资源，由于编码细胞中相当数量的蛋白质分子，对株高、茎径、分蘖等外观农艺性状、育性以及抗性有显著的影响。Rajcan等[6]研究发现不同细胞质源的油菜Reston和LL 09作亲本正反交，其F1群体的开花期、成熟期、株高和种子的特性有显著的差异，认为油菜的许多农艺性状受细胞质基因控制，母本的选择对性状的表现有很大的影响；Bernet等[7]在芸香科柑橘C. clementina和柚子C. grandis的正反交试验中证实，不同母本可使后代果实的大小、口味及色泽有很大的差异；Moriguchi等[8]利用cpDNA和mtDNA的特异条带区分兴安落叶松和日本落叶松，证实利用单母细胞克隆（SMC）克服了松属的自交不亲和现象，表明细胞质基因与松属的育性相关；Wang等[9]研究认为，细胞质基因影响马铃薯的抗性；Lal等[10]研究5个不同细胞质源的罂粟亲本对后代的影响，认为不同细胞质源亲本对罂粟的茎秆性状有显著影响。由以上研究可推断，细胞质源或细胞质基因对农艺性状、抗性有影响，利用适宜的细胞质基因可改良植物的农艺性状、抗性等有关性状。

在甘蔗细胞质相关研究方面，D'Hont等[11]利用RFLP技术对甘蔗属内57个不同地域来源的栽培品种和野生种质的细胞质基因多样性进行研究，认为这些种质的mtDNA多态性丰富，依据线粒体的聚类分析与野生种质根据表型和同工酶的系统分类一致；唐仕云等[12-13]认为母本细胞质源对正反交后代开花特性、净光合速率、株高、茎径、锤度等性状有显著影响；盛孝邦[14]总结中国甘蔗育种多年的研究资料，得出了在不同的杂交组合中母本的细胞质源在后代中有较强的遗传效应的结论；美国农业部荷马甘蔗研究所Pan等[15-16]从本世纪初开展了割手密细胞质源利用的研究，其研究小组利用19对cpSSR引物研究了崖城割手密及其后代共4个材料的叶绿体基因组，认为叶绿体基因的多态性说明了崖城割手密的进化趋异[17]，并成功地于2012年释放了一个含割手密细胞质的能源甘蔗新品种Ho02-113[18]；广西农业科学院甘蔗研究所近年来利用斑茅和割手密杂交，成功创制斑茅割手密复合体，获得了在产量相关性状和抗性上表现出较强优势的具有割手密细胞质源的育种材料[19]。

目前，不同亲本细胞质源对甘蔗杂交后代主要性状的影响鲜见报道，本研究拟利用不同细胞质源的甘蔗亲本配成正、反杂交组合，分别对正交和反交后代群体进行主要性状差异分析，研究不同细胞质源的甘蔗亲本与甘蔗主要性状遗传表现的相关性，为甘蔗育种利用优异细胞质源，以及进一步从分子水平上研究和发掘甘蔗优异细胞质基因奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

参试亲本来自中国农科院甘蔗研究中心海南甘蔗杂交基地和广州甘蔗糖业研究所海南甘蔗育种场，杂交统一采用人工授粉的方法，父本采用50 ℃温汤处理10 min的方法去雄，所用花粉量及被授小花数相当。所配组合及亲本细胞质源如表1。

1.2 方法

1.2.1 正反交组合F1代杂种真伪鉴别 将收获的花穗晾晒干燥后，于2011年2月称取每穗种子50 g播种育苗，苗高15 cm左右时剪叶提取总DNA，采用SSR-PCR技术进行分子鉴定，参考Singh等[20]的方法，对杂交组合F1的基因组DNA进行SSR-PCR扩增，扩增产物在聚丙稀酰胺凝胶上进行电泳检测，扩增产物中具有双亲特征条带的即为真杂种，只有母本特征条带而无父本特征带的后代为假杂种或自交种。

1.2.2 正反交后代种植及主要农艺性状鉴定

2011年3月，将所有组合的真杂种移苗定植在广西甘蔗研究所隆安实验基地，常规种植管理，大田生长11个月后，于2012年2月砍茎留种并种植，每个单株种植12个芽，3次重复，按常规方法调查株高、茎径、有效茎数、蔗汁垂度和自然条件下黑穗病发病率（种植田块常年开展黑穗病抗性试验，对照种ROC22在2011年的黑穗病发病率为24%，2012年为22.9%）；2012年9月5日，利用SPAD-520型手持叶绿素仪，测定叶绿素含量，测定每个单株的主茎及所有分蘖的+1叶并取平均值。2012年12月砍收后，留宿根，2013年重复收集以上数据。

1.2.3 细胞质源与农艺性状相关性分析 编号为514、473、515和478的组合为2012～2013年杂交季新选配组合，只有杂种圃当年数据；其余编号分别为102、68、92、107、135、138、47、48、100和132的组合将2012和2013年所调查的农艺性状数据平均，以正交组合后代群体和反交组合后代群体为2个独立样本，利用SAS8.0软件进行两独立样本的均数t检验，正交组合性状和反交组合性状间差异显著的认为正反交对该性状有影响。

1.3 数据处理

原始数据录入、整理和均数计算等采用Excel软件，方差分析和均数t检验利用SAS8.0软件完成。

2 结果与分析

2.1 不同细胞质源对杂交后代真实性的影响

在66对SSR引物中筛选出18对具有双亲特征条带的SSR引物，利用这18对SSR引物对5对正反交组合后代材料进行鉴定，其中不具备父母本特征条带的材料鉴定为自交种或假杂种；其余同时具有双亲的特征条带的材料，鉴定为真杂种。如图1所示，样品2具有约50、250、270 bp大小的父本特征带和约120 bp大小的母本特征带，鉴定为真杂种；从图2中可以看出，样品18分别在大小约120、320、400、430 bp处具有父本特征带，在大小约240 bp处具有母本特征条带，鉴定为真杂种。

利用18对SSR引物共鉴定后代材料640个（表2），其中100和132组合共76个，47和48组合共149个，92和107组合共140个，102和68组合共143个，135和138组合共132个，真杂种率最高的组合为47组合，达到98.8%，最低的是102组合，仅为40.4%。真杂种率高于90%的3个组合47、92和68组合的母本细胞质源都是Black Cheribon；在真杂种率低于70%的3个组合102组合、135组合和107组合中，有2个组合的母本细胞质源为Bandjarmasim Hitam，1个组合的细胞质源为Kaludia Boothan。

2.2 正反交组合主要性状比较分析

对不同细胞质来源的7对正反交组合的株高、茎径、有效茎数、叶绿素含量以及自然条件下黑穗病的发病率共5个性状进行调查和分析（表3），除了515和473、514和481 2对4个组合的黑穗病发病率以及135和138组合的叶绿素含量在数值上有较大差异外，其余的 68和102、92和107组合的株高、茎径、有效茎数、叶绿素含量以及100和132、47和48组合的叶绿素含量都差别不大。

2.3 细胞质源与农艺性状相关性分析

对参试的4个不同细胞质源亲本材料组配的正反交组合后代进行t检验（表4），发现参试组合的株高、茎秆和有效茎数都没有明显差异，135和138组合的叶绿素含量差异虽然达到显著水平，但他们的母本细胞质源同为Bandjarmasim Hitam，说明以上性状主要受核基因控制，受正反交影响较小。515和481、514和473的黑穗病发病率分别为28.4和18.8、28.8和18.9，正反交之间t检验证实P=0.006 36和P=0.007 81，2对正反交组合间差异都达到极显著水平，而且这2对正反交组合的亲本细胞质源组成相同，都是Badila和Bandjarmasim Hitam，当以细胞质源同为Bandjarmasim Hitam的不同亲本材料ROC22和ROC26作母本时，子代黑穗病发病率几乎一致，为18.8%和18.9%，当以细胞质源为Badila的崖城58-47为母本分别与ROC22和ROC26配成正反交组合时，子代的黑穗病发病率也非常接近，分别为28.4%和28.8%。

3 讨论与结论

3.1 不同细胞质源与真杂种率的关系

Wettstein[21]在1924年最早证实细胞质基因与花粉育性相关。30年后，Michaelis[22]也在柳叶菜属中证实细胞质基因决定了花粉的育性。在其后的几十年间，细胞质基因与育性相关的研究理论被广泛地研究和应用。其中以细胞质雄性不育为基础的三系育种法在水稻[23-24]、小麦[25]、玉米[26]、甘蓝[27-29]、烟草[30]等作物育种中发挥重要作用。虽然细胞质基因与花粉育性的相关研究已经开展了近一个世纪，但在甘蔗上却未见相关报道。在本研究中，真杂种率高于90%的3个组合47、92和68组合的母本细胞质源都是Black Cheribon，在真杂种率低于68.4%的3个组合102、135和107组合中，有2个组合的母本细胞质源为Bandjarmasim Hitam，1个组合的细胞质源为Kaludia Boothan。虽然Black Cheribon、Bandjarmasim Hitam和Kaludia Boothan这3个细胞质同来源于甘蔗热带种，但对花粉育性的影响却差异很大，说明其叶绿体基因和线粒体基因存在差异。巴西[31]和日本[32]分别对2个甘蔗栽培种SP80-3280和NCo 310的叶绿体基因组进行测序，发现这2个品种的叶绿体基因组发生了1～2个碱基序列的改变，由于叶绿体基因和线粒体基因高度保守，1～2个碱基的差异也表明了2个品种在进化上的趋异。在长期的自然演化和人工选择过程中，Black Cheribon、Bandjarmasim Hitam和Kaludia Boothan这3个细胞质源累积的进化和遗传变异，也许就是该研究中不同甘蔗细胞质源对甘蔗花粉育性产生不同影响进而得到不同真杂种率的原因所在。

3.2 不同细胞质源与农艺性状差异的关系

在笔者的研究中，参试的正反交组合在株高、茎径、有效茎数差异不明显，仅有3对正反交组合分别在感黑穗病率和叶绿素含量上有显著差异，但叶绿素含量差异显著的2个正反交组合的父母本的细胞质源相同，说明叶绿体含量的差异并不是由细胞质基因引起。可能的原因是株高、茎径、有效茎及叶绿素含量等数量性状，由大量微效基因的加性效应控制，不同细胞质源或是核质互作效应都可能对其产生较大影响，且由于甘蔗是复杂的非整倍体和多倍体植物，正反交后代核基因发生分离，正反交群体间，甚至是F1群体的个体间核基因都存在差异，这些差异很可能掩盖了不同细胞质基因对性状的影响。但在Natarajan等[33]的研究中证实，不同细胞质材料作母本，对后代的有效茎数、株高、锤度等农艺性状有影响，以Co.678为母本正交时，其后代的株高明显高于反交群体，当以Co.527为母本时，正反交后代之间的有效茎数、锤度差异显著；唐仕云等[12-13]也认为，不同亲本正反交对甘蔗后代开花特性、净光合速率、株高、茎径、锤度等性状有显著影响；Zhu等[34]检测了4个甘蔗栽培种、8个割手密和3个具有割手密细胞质源的杂交F1材料，在检测的19个位点中，发现10个具有多态性。这进一步说明细胞质基因存在丰富的遗传多态性。有可能本研究使用的甘蔗亲本细胞质源局限于甘蔗热带种，由于遗传背景差异不大，也许不是一个好的分析群体。

3.3 不同细胞质源与抗性的关系

Wang等[9]和徐乃瑜等[35]研究认为，细胞质基因与抗性密切相关；林日坚[36]认为，线粒体基因相比叶绿体基因对抗逆性和抗病性的影响更大。在刘云龙等[37]对甘蔗细胞质源与眼斑病抗性的关系研究中，发现Black Cheribon作为细胞质源在抗性材料中的比例比在感性材料中的比例大29.0%，而且CP49-50（细胞质源为Black Cheribon）与F134正交后代表现为抗，反交后代表现为感；同时发现在抗性材料中有6个高抗品种，其中5个的父母本一方为CP49-50，说明Black Cheribon细胞质源有利于提高甘蔗的眼斑病抗性。在本研究中，2对亲本细胞质源分别为Badila和Bandjarmasim Hitam的材料正反交，其组合间黑穗病的发病率差异都达到极显著水平，而且以Badila细胞质源的崖城58-47为母本组配的2个组合后代，子代的发病率非常接近为28.8%和28.4%。ROC22和ROC26的细胞质源都为Bandjarmasim Hitam，分别以ROC22和ROC26为母本与崖城58-47组配时，其后代的黑穗病发病率也几乎一致，为18.8%和18.9%，初步推断Bandjarmasim Hitam细胞质源对黑穗病的抗性显著高于Badila，这值得进一步研究。

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