基于葡萄柚叶片离体再生体系的研究

陶燕蓝　蓝增全　吴田

摘 要 以10个葡萄柚品种种子萌发的无菌苗叶片为外植体，研究葡萄柚的离体再生体系。结果表明：在MS+1.0 mg/L 2，4-D+6%蔗糖培养基上，8个葡萄柚品种能诱导出愈伤组织，其中“星路比”品种诱导率最高为46.67%，将诱导的愈伤组织转移至相同培养基中可继代增殖；“帕利斯”、“星路比”、“泰国种”3个品种的叶愈伤组织接种于MS+3.0 mg/L 6-BA分化培养基上可分化出丛生芽，这些丛生芽在MS+0.2 mg/L 6-BA培养基上平均可增殖4～6个芽；丛生芽在1/2 MS+1.0 mg/L IBA生根培养基上可诱导出不定根。炼苗后，田间移栽成活率为78.18%。为后续葡萄柚良种选育及遗传转化体系的建立奠定基础。

关键词 葡萄柚；再生植株；愈伤组织；不定芽

中图分类号 Q943.1 文献标识码 A

Abstract The leaves of aseptic seedlings from the seeds of ten grapefruit varieties as explants were used to establish the in vitro regeneration system of grapefruit. The results showed that the callus of eight grapefruit varieties were observed in the medium MS+1.0 mg/L 2，4-D+6% sugar， and “Star Ruby”had the highest callus induction frequency， which is 46.67%. The multiplication medium of the callus was the same medium. The medium of the differentiation of adventitious buds of three grapefruit varieties“Perlist”“Star Ruby”and “Thailand” was MS+3.0 mg/L 6-BA. The medium for multiplication of the regeneration buds was MS+0.2 mg/L 6-BA， and the rooting medium was 1/2 MS+1.0 mg/L IBA. The survival rate of regenerative plant was 78.18%. In order to provide useful references for the breeding and the application of genetic transformation technique in grapefruit.

Key words Citrus paradisi Macf.；Regenerative plant；Callus；Adventitious bud

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2015.03.007

葡萄柚（Citrus paradisi Macf.）是芸香科柑橘属亚热带常绿果树，为甜橙和柚的天然杂交种，是世界柑桔类四大类群之一[1]，因果实悬挂成串，簇生如葡萄，故称葡萄柚[2]。葡萄柚起源于西印度群岛的巴巴多斯，在欧美地区大量种植，中国种植较晚[3]。葡萄柚的营养价值丰富、果实柔嫩、风味独特，既可鲜食，又可加工制成罐头、果汁及色拉等原料[4-6]，越来越受到世界各国的生产者和消费者的喜爱，因此发展葡萄柚种植具有可观的前景[7]。

葡萄柚主要通过接穗嫁接栽培[8]，不仅费工费时，而且易造成品种退化，给葡萄柚的生产带来损失。通过建立高效的离体再生体系，能有效克服传统繁殖方式的弊端，为葡萄柚的原体苗木遗传育种、基因转化及品种改良提供重要基础。叶片是植物光合作用的重要器官，又是某些植物的繁殖器官，很多植物的叶片具有比较强的再生能力，能够产生再生植株，叶片离体培养在植物器官培养中占有一席之地，目前已从水稻、小麦、油菜、番茄、杨树、菊花、百合、猕猴桃、桃等百余种植物的叶片培养中获得了再生植株[9-10]。周梦春等[11]用琯溪蜜柚、沙田柚和江津柚的叶片诱导出了愈伤组织。邓群仙[12]以酸柚、中江柚的叶片为外植体时，始终未能诱导出芽。在果树离体叶片培养中，对愈伤组织的诱导和生长影响效果比较显著的是2，4-D[13]。黄涛等[14]通过研究沙田柚叶片离体再生的影响因素表明，2，4-D可诱导沙田柚叶片愈伤组织的形成。

云南省于2002年初次从美国引进9个葡萄柚品种（品系），并相继开始了相关研究[15-17]。目前，关于葡萄柚离体再生培养方面已有探索，以邓肯葡萄柚实生苗上胚轴为材料进行培养，成功获得了再生植株[18-19]。但以葡萄柚叶片为外植体进行离体再生方面的研究国内尚未见系统报道。本试验拟采用10个葡萄柚品种的组培苗叶片为试材，对其进行离体再生培养，并为进一步的无性变异体筛选和采用基因工程进行遗传改良奠定良好基础。

1 材料与方法

1.1 材料

供试材料是从美国引进嫁接栽培在云南省西双版纳州普文镇试验林场的9个葡萄柚品种，分别为火焰（Flame）、矮化（Genetic Dwarf）、亨路比（Henderson Ruby）、哈路比（Hudson Foster）、帕利斯（Perlist）、瑞路比（Ray Ruby）、里德马叙（Reed Marsh）、里约红（Rio Red）、星路比（Star Ruby），以及泰国种（Thailand）葡萄柚的种子，以其种子萌发的无菌苗为试验材料。

1.2 方法

1.2.1 无菌苗的培养 取新鲜饱满的葡萄柚种子，剥去外种皮（图1），然后在超净工作台上经5%次氯酸钠灭菌5 min后，用75%的酒精处理30 s，然后用无菌水清洗3～5次，置于滤纸上吸干多余的水分，最后接种于MT培养基（不加特殊说明时，培养基蔗糖浓度为3%，琼脂为0.7%，pH值5.8）中培养。培养室恒温（25±2）℃，先采用暗培养，待芽长至1 cm左右时将其光照培养，光照为100 μmol/（m2·s），光照时间为12 h/d。当培养40 d后，取叶片用于愈伤组织诱导。

1.2.2 愈伤组织诱导 取种子萌发较快、长势较好的星路比葡萄柚叶片接种于以下3种培养基上培养：MS+1.0 mg/L NAA+6%蔗糖+0.6%琼脂、MS+1.0 mg/L 2，4-D+6%蔗糖+0.6%琼脂、MS+1.0 mg/L 6-BA+6%蔗糖+0.6%琼脂，以筛选出葡萄柚叶片愈伤组织诱导最佳的培养基配方。为研究不同品种（基因型）对叶愈伤组织诱导培养基的敏感性，分别取其它9个葡萄柚品种无菌苗叶片，剪去叶尖和叶缘，剪成1 cm×1 cm方片，正面向上放于筛选出的最佳诱导愈伤培养基上诱导培养。每瓶培养基中接种5块，每个品种接种6瓶。培养过程中每5 d观察1次，40 d后统计愈伤组织的生长状况。

1.2.3 不定芽诱导及增殖 筛选出敏感性强的葡萄柚品种，对其叶愈伤组织进行分化诱导。分化不定芽诱导培养基有以下3种：MS+1.0 mg/L 6-BA、MS+2.0 mg/L 6-BA、MS+3.0 mg/L 6-BA，培养条件同1.2.1。培养50 d后统计每块愈伤组织上不定芽的数量，并计算不定芽分化率和平均每个外植体分化芽数。分化出的不定芽转至MS+0.2 mg/L 6-BA培养基上进行增殖培养。

1.2.4 不定根诱导 不定芽生长至2～4 cm时，从茎基部切下接种于1/2 MS+1.0 mg/L IBA（3%蔗糖、0.65%琼脂、pH5.8）的生根培养基上（参照本研究小组扩繁体系试验），诱导无菌苗生根，获得完整植株。

1.2.5 炼苗移栽 已生根的试管苗在移栽前先打开封口膜，常温下放置2 d，对其进行驯化以提高组培苗的适应能力。2 d后取出并小心地洗去培养基，移栽到蛭石与沙壤土对半的营养钵中，置于大棚内遮荫培养1周后正常光照培养，每2～3 d进行喷水保湿，棚内恒温（25±2）℃，湿度保持60%～75%，50 d后统计成活率。

1.3 评价指标与数据调查

所有数据均采用SPSS11.5软件、Excel2003进行分析。愈伤组织诱导率、不定芽分化率和平均每个外植体分化芽数根据以下公式计算：

愈伤诱导率=（产生愈伤组织外植体数/接种外植体数）×100%

不定芽分化率=（分化不定芽的外植体总数/接种外植体总数）×100%

平均每个外植体分化芽数=外植体分化不定芽总数/分化不定芽外植体数

2 结果与分析

2.1 不同激素对“星路比”叶片愈伤组织诱导的影响

由表1可知，“星路比”叶片在MS+1.0 mg/L 2，4-D培养基上的愈伤诱导率最好，为48.89%，愈伤组织致密有光泽，较肥大（图2-A～C）；在MS+1.0 mg/L NAA培养基上可诱导出少量淡黄色愈伤，愈伤诱导率为15.56%；在MS+1.0 mg/L 6-BA培养基培养初期叶片卷缩，切口处逐渐褐化成枯状，部分叶片呈白化状，最后未形成愈伤。

2.2 不同葡萄柚品种叶片愈伤组织的诱导及增殖

外植体接种后放于培养室培养，从培养过程中发现，外植体接种20 d后，其切口处卷缩出现少量乳白至淡黄色致密的愈伤组织；40 d后，由切口处延伸的愈伤组织逐渐变大，可见愈伤组织慢慢变至乳白略呈淡黄绿色，结构致密，质地较硬，表面湿润，晶莹光亮；此时的愈伤组织转至相同培养基上可进行继代增殖，能有效保持其快速生长的状态。但随着培养时间的延长，愈伤组织颜色不断加深，表面局部出现褐色，外观干燥，呈老化状态，用这样的愈伤组织继代培养，不能保持其快速生长的状态，增殖数量有限，且衰败速度也快。因此产生的愈伤组织应在培养20 d左右处于新鲜健壮时及时继代培养。

为保证增殖数量，继代之后的愈伤组织每30 d继代1次。由表2可知，在MS+1.0 mg/L 2，4-D+6%蔗糖培养基上，“星路比”叶片愈伤组织诱导率较高，为46.67%；“火焰”和“亨路比”愈伤组织诱导率较低，为16.67%。在相同培养基上，“矮化”和“瑞路比”在培养10 d左右时，切口开始褐化，20 d时，部分切口长出微量的淡黄绿色愈伤组织并逐渐褐化，最后未获得诱导愈伤；其余8个葡萄柚品种叶片愈伤组织诱导率排序为：星路比（46.67%）>泰国种（36.67%）>里德马叙（33.33%）>帕利斯（26.67%）>哈路比（23.33%）>里约红（20.00%）>火焰和亨路比（16.67%）（表2）。“火焰”、“亨路比”、“哈路比”、“帕利斯”、“里德马叙”、“里约红”、“星路比”、“泰国种”8个品种诱导出的乳白略呈淡黄绿色致密坚硬的愈伤组织在相同培养基上可进一步增殖。由于“火焰”、“亨路比”、“哈路比”、“里德马叙”、“里约红”5个品种产生的愈伤组织较小，只零星分布于卷曲叶片的周围，增殖速度也较慢；“帕利斯”、“星路比”、“泰国种”3个品种愈伤组织量较多，因此接下来选用这3个品种进行丛生芽的诱导试验。

2.3 不同葡萄柚品种叶片愈伤组织不定芽的分化及增殖

由表3可知，由“帕利斯”、“星路比”、“泰国种”3个葡萄柚品种叶片诱导出的乳白略呈淡黄绿色、致密、坚硬愈伤组织在MS+1.0 mg/L 6-BA、MS+2.0 mg/L 6-BA、MS+3.0 mg/L 6-BA 3种培养基上均可分化出不定芽。3个品种在分化芽数、不定芽分化率和分化芽生长情况上所呈现的趋势都是在3.0 mg/L 6-BA处理下的诱导率高于1.0 mg/L和2.0 mg/L处理下的诱导率。其中“星路比”叶愈伤组织不定芽分化率最高，为48.00%，平均每个外植体分化芽数约为3.2；“泰国种”分化率最低，为17.50%，平均每个外植体分化芽数约为1.3。3个品种之间分化芽数及不定芽分化率差异不显著。由于基因型不同，3个品种不定芽分化率和平均每个外植体分化芽数及生长状态有所不同。“星路比”芽增殖方式为丛生和单生，再生芽健壮，长势较好（图2-D）；“帕利斯”芽繁殖方式多为单生，在高浓度6-BA处理下为丛生，再生芽长势一般（图3-B）；“泰国种”再生芽增殖方式主要为丛生，但芽弱小，生长较慢（图3-E）。愈伤组织上分化出的不定芽转移到MS+0.2 mg/L 6-BA培养基上增殖培养时，可平均增殖4～6个芽（图4）。

2.4 不定根的诱导

将长至2～4 cm的不定芽，从茎基部切下接种到生根培养基上，置于光照条件下进行培养。结果表明，3个葡萄柚品种的不定芽均可诱导出不定根。“泰国种”的生根率最高，为87.88%；“帕利斯”的较低，为66.67%（表4）。培养30 d后，从不定梢的基部生出1～3条乳白色不定根。“泰国种”的生根时间早于“帕利斯”和“星路比”，10 d左右就有根长出（图3-F）。

2.5 炼苗移栽

“帕利斯”、“星路比”、“泰国种”3个品种通过炼苗具有一定适应性后移栽至蛭石与沙壤土对半的营养钵上，其成活率约为78.18%。移栽初期，由于组培苗的叶子保湿反光性差，易失水焉萎，需经常浇水以保持湿度。20 d左右组培苗抽出新叶，50 d后随着根系增粗和伸长，植株增高明显，叶片多且绿。“泰国种”的植株表现优于“帕利斯”和“星路比”。

3 讨论与结论

培养基中的激素被认为是叶片再生的最重要因素。本试验首先以“星路比”叶片为培养对象，在单独添加1.0 mg/L 2，4-D、1.0 mg/L NAA的培养基上均可产生愈伤组织，但2，4-D的诱导率优于NAA的诱导率，在单独添加1.0 mg/L 6-BA的培养基上未获得愈伤组织，说明2，4-D更适合葡萄柚叶片愈伤组织的诱导。黄涛等[14]和周梦春等[20]的研究结果也表明1.0 mg/L 2，4-D与6%蔗糖处理的叶片愈伤组织诱导率最高。叶片离体再生不定芽的发生通常有2种方式，一种是先诱导形成愈伤组织，然后从愈伤组织分化产生不定芽，另一种则是诱导叶片上直接长出不定芽[21]。有研究结果显示，草莓通过诱导叶片上直接长出不定芽的方式完成离体叶片再生体系[22-23]，越橘叶片离体再生方式同样是在叶片上直接长出不定芽[24]，昌红苹果离体叶片不定芽再生方式则经过愈伤后形成[25]。贺红等[26]以红江橙叶片为外植体进行研究时，出芽途径以直接出芽为主。本研究结果中发现，葡萄柚离体叶片离体再生不定芽的方式需要诱导形成愈伤，再在愈伤组织上分化产生不定芽。

叶片的离体再生能力与基因型有着直接的关系，外植体基因型是决定叶片离体再生能力及再生率高低的主要因素[27]。相同处理条件下，受供体材料基因型的影响，葡萄柚愈伤组织诱导能力不同。本研究的10个葡萄柚品种叶片在相同培养条件下，“火焰”、“亨路比”、“哈路比”、“帕利斯”、“里德马叙”、“里约红”、“星路比”、“泰国种”8个品种均可获得愈伤组织，但“火焰”和“亨路比”的诱导率较低，“矮化”和“瑞路比”未获得愈伤组织。邹美金等[28]的研究结果也发现柚类组织培养存在明显的基因型效应。无论从愈伤组织诱导率、丛生芽分化率还是丛生芽生长情况而言，“星路比”都明显高于其它品种如“帕利斯”和“泰国种”。这可能是源于不同基因型外植体本身内源激素的差异，不同品种间遗传和生理上存在差异会影响细胞脱分化和再分化，导致不同基因型材料间再生表现的差异[21]。同一植物不同品种，外植体所需最佳再生培养基和植物生长调节剂水平也不尽相同。因此，在今后的实验中将针对不同葡萄柚品种对激素种类及其浓度配比进行优化，进一步提高各个葡萄柚品种的叶片离体再生率。

本试验对葡萄柚品种离体叶片再生体系的建立进行了初步摸索，已掌握了有效愈伤的诱导与继代、不定芽的诱导与增殖、不定根的诱导等技术，这将为后续葡萄柚良种选育及遗传转化体系的建立提供良好基础。

参考文献

[1] 叶荫民. 葡萄柚（Citrus paradise Macf.）及其在我国的发展前景[J]. 中国南方果树， 1997， 26（5）： 7-9.

[2] 杨连珍. 葡萄柚概述[J]. 中国南方果树， 1996， 25（2）： 67-71. [3] 郭林榕， 陈文光， 熊月明. 葡萄柚的产销及发展前景[J]. 福建果树， 2002， 22（3）： 93-96.

[4] 吴海波，刘惠民. 葡萄柚的栽培及研究概况[J]. 经济林研究，2005， 23（1）： 69-73.

[5] 柴 倩. 橘皮精油提取、成分分析及其贮藏加工过程中的品质变化研究[D]. 武汉， 华中农业大学， 2007.

[6] 沈思强， 蒋卓勤， 罗晓琳，等. 星路比葡萄柚化学成分分析及营养评价[J]. 广东农业科学， 2009， 36（8）： 160-161.

[7] 刘晓东，郝开兰. 对开发葡萄柚之我见[J]. 中国南方果树，1997， 26（6）： 9-10.

[8] 严 毅， 李贤忠， 张南新，等. 葡萄柚不同砧穗组合的嫁接亲和性[J]. 经济林研究， 2012， 30（1）： 103-107.

[9] 巩振辉，申书兴. 植物组织培养[M]. 北京：化学工业出版社，2007： 68-69.

[10] 李果果. 桃砧木GF677叶片离体再生和愈伤组织诱导保存[D]. 武汉： 华中农业大学， 2011.

[11] 周梦春， 苏智先，胡进耀，等. 三种柚子品种的离体快速繁殖[J]. 生物学杂志， 2010， 27（3）： 81-83.

[12] 邓群仙. 柚离体繁殖技术体系研究[D]. 雅安：四川农业大学，2002.

[13] 杨 宁， 杨 红， 杨颖丽，等. 核果类果树组织培养及遗传转化的研究进展[J]. 西北师范大学学报：自然科学版， 2005， 41（1）： 94-100.

[14] 黄 涛， 董高峰， 张兰英，等. 影响沙田柚叶片离体培养的因素研究[J]. 广西植物， 2003， 23（6）： 561-564.

[15] 史海芝， 刘惠民， 李贤忠，等. 引进美国葡萄柚果实营养分析[J]. 山东林业科技， 2009， 25（2）： 28-31.

[16] 吴 田，蓝增全. 葡萄柚基因组DNA提取方法的比较及ISSR-PCR体系的优化[J]. 中国农学通报， 2010， 26（23）： 48-52.

[17] 刘惠民， 何承忠，孟 瑜，等. 引进葡萄柚品种基因资源的AFLP分析[J]. 经济林研究， 2008， 26（2）： 1-5.

[18] 陆荣生， 韩美丽， 霍秀娟，等. 葡萄柚不定芽再生体系建立研究[J]. 江西农业学报， 2013， 25（6）： 35-38.

[19] 韩美丽， 陆荣生， 林 睿，等. 农杆菌介导的葡萄柚转化再生体系建立研究[J]. 南方农业学报， 2013， 44（7）： 1 081-1 086. [20] 周梦春， 苏智先， 胡进耀，等. 三种柚叶悬浮培养愈伤组织黄酮类有效成分的比较研究[J]. 绵阳师范学院学报， 2009， 28（2）： 51-55.

[21] 黄学林，李莜菊. 高等植物组织离体培养的形态建成及其调控[M]. 北京： 科学出版社， 1995： 387-391.

[22] 王 翡， 高志红， 章 镇，等. 草莓高效离体叶片再生体系的建立[J]. 西北植物学报， 2010， 30（5）： 1 045-1 049.

[23] 孙瑞芬， 李天然， 李 堃，等. 草莓组培快繁及叶片诱导植株再生的研究[J]. 华北农学报， 2002， 17（3）： 49-53.

[24] 毕海涛. 越橘叶片离体再生与BADH基因遗传转化的研究[D]. 长春： 吉林农业大学， 2007.

[25] 吴雅琴， 赵艳华，李春敏. 昌红苹果离体叶片不定芽的诱导及植株再生[J]. 云南农业大学学报， 2006， 21（1）： 32-35.

[26] 贺 红， 韩美丽， 何亚文，等. 红江橙不同外植体离体培养的研究（简报）[J]. 热带亚热带植物学报， 1997， 5（2）： 85-88.

[27] 焦 展. 品种及砧木离体叶片再生体系的建立的研究[D]. 保定： 河北农业大学， 2008.

[28] 邹金美， 余金富， 叶国利，等. 文旦柚和下河蜜柚组织培养快速无性繁殖[J]. 漳州师范学院学报： 自然科学版， 2006， 18（2）： 74-77.