苦瓜McAGD8和小G蛋白McRABD2c基因全长cDNA的分离及序列分析

冯冬林　许端详　高山

摘 要 构建并筛选苦瓜成熟果实cDNA文库，分离获得2个全长cDNA序列（命名为McRABD2c和McAGD8）。序列分析结果表明：McAGD8长度为1 695 bp，含有1个1 209 bp开放阅读框，编码403个氨基酸，该蛋白含有1个保守的Arf GAP结构域，与黄瓜CsAGD8-like具有90%的同源性，同甜瓜CmAGD8具有89%的同源性。McRABD2c长度为1 166 bp，含有1个609 bp开放阅读框，推测编码202个氨基酸，该蛋白含有Rab家族保守的RabSF（RabSF1-RabSF4）模体及特有的RabF模体（RabF1-RabF5）；5个G结构域和2个构象变构域（SwitchⅠ、SwitchⅡ）及C末端的CCX序列，同CsRABD2C-like同源性高达99%。氨基酸同源比对及进化分析结果表明McRABD2属于小G蛋白，而McAGD8属于Arf小G蛋白下游的效应基因。

关键词 苦瓜；McRABD2c；McAGD8；序列分析

中图分类号 Q781 文献标识码 A

Abstract Constructing and screening the ripe fruit cDNA library of Momordica charantia， Two full-length cDNA was isolated and designated as McAGD8 and McRABD2c separately. Sequence analysis showed that the McAGD8 is 1 695 bp in length with a complete 1 209 bp ORF and a Arf GAP domain， and encodes 403 amino acids. The comparison of deduced amino acids sequence revealed that the McAGD8 with 90% and 89% similarity respectively to the CsAGD8-like of cucumber and CmAGD8 of melon. The McRABD2c is 1 166 bp in length with a complete 609 bp ORF， and encodes 202 amino acids. McRABD2c protein included conserved RabSF（RabSF1-RabSF4）and RabF（RabF1-RabF5）motif of Rab GTPases subfamily， and five signature motif of phosphate loop（G1-G5）， two conformational switch（SwitchⅠ、SwitchⅡ）and C-terminal cysteines motif CCX. The McRABD2c showed 99% similarity with CsRABD2C-like of cucumber. Amino acids similarity and phylogenetic analysis indicated that McRABD2c is a small GTP-binding protein of Rab family， McAGD8 is a downstream effector of small GTP-binding protein Arf family.

Key words Momordica charantia； McRABD2c； McAGD8； Sequence analysis

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2015.03.006

小G蛋白（small GTPases）是一类普遍存在于真核细胞内的单体GTP结合蛋白，属于RAS超家族。该家族成员具有高度保守的结构及GTPases水解活性。小G蛋白家族成员众多，根据结构和功能的相似性可以分为Ras、Rab、Rho、Arf和Ran 5个不同的亚族[1]。

Rab GTPases家族是小G蛋白家族中最大的一个成员，广泛分布于从酵母、植物、植物及人类的真核生物中。植物Rab家族由8个亚族组成，命名为RabA、RabB、RabC、RabD、RabE、RabF、RabG、RabH。已有研究结果表明，Rab家族蛋白参与不同的运输途径，包括内吞作用、细胞质分裂、后高尔基体运输到细胞质膜和液泡[2]。还参与植物生长发育过程，如胚胎发育、花粉管萌发、根毛发育等和各种胁迫应答反应[3-9]。

小G蛋白在细胞信号转导过程中发挥“分子开关”作用，通过上游鸟苷酸交换因子（guanine nucleotide exchange factors，GEFs）将非激活态（GDT-bound）小G蛋白激活为激活态（GTP-bound），并通过与下游效应子GAPs（GTPases activating proteins）将激活态的GTP水解为非激活态的GDP和Pi来调解小G蛋白周期循环[10]。ArfGAPs基因所含GAP结构域，应答激活Arf GTPase，其他结构域参与蛋白-蛋白互作和蛋白-油脂互作[10-11]。同时ArfGAPs具有独立的功能，ArfGAP1能够增强衣被蛋白的亲和性，Glo3p-type ArfGAPs（Glo3p，ArfGAP2，ArfGAP3）参与动物和酵母细胞内衣被蛋白Ⅰ（COPⅠ）生物合成[12-16]。最新研究结果表明拟南芥中位于高尔基体的2个同源性较高的ArfGAP，AGD8和AGD9参与保持高尔基体形态，在植物生长发育中具有重要作用[17]。

苦瓜是一种重要的蔬菜作物，对苦瓜的一些重要调节基因的研究是有效开展苦瓜遗传改良的重要基础。苦瓜小G蛋白McRABD2c和小G蛋白下游效应子基因McAGD8的克隆及序列分析，对研究苦瓜McRABD2c和McAGD8基因相关功能及相关信号通路奠定基础。

1 材料与方法

1.1 植物材料

苦瓜cDNA文库为本单位实验室构建。苦瓜材料为福州市蔬菜科学研究所育成品种佳玉。提取苦瓜成熟果实果肉RNA，并构建cDNA文库。

1.2 方法

基因克隆与序列分析：随机挑取cDNA文库阳性克隆，以M13R为测序引物，测序。将获得的序列从GenBank（www.ncbi.nlm.gov）进行同源比对。应用DNAMAN软件对基因序列及编码的蛋白质进行分析；采用ExPaSy-PROSITE分析蛋白质结构域；ProtParam预测相对分子量和等电点；应用Mega6.01软件分别分析McRABAD2C、McAGD8同拟南芥相关基因蛋白序列，并构建系统进化树。

2 结果与分析

2.1 苦瓜McRABD2c、McAGD8基因的克隆与序列分析

本研究从苦瓜cDNA文库中分离获得1个苦瓜小G蛋白（Rab）和1个Arf-GTPases激活蛋白阳性克隆。经测序去除载体序列后表明cDNA长度分别为1 166 bp和1 695 bp，分别包含609 bp和1 209 bp的完整开放阅读框，分别编码202个和403个氨基酸的蛋白（图1、图2）。ProtParam预测McRABD2c分子量为22.551 5 ku，理论等电点为5.29；McAGD8分子量为43.396 2 ku，理论等电点为9.0。

2.2 蛋白序列分析

2.2.1 苦瓜McRABD2c保守结构域及系统进化分析

分析苦瓜McRABD2c氨基酸序列结果表明：该基因具有GTP/Mg2+结合位点及GDI和GEF互作位点；Rab-GTPases家族保守的RabSF模体（RabSF1-RabSF4）；Rab亚家族蛋白所特有的RabF模体（RabF1-RabF5）；参与GTP/Mg2+结合和GTP水解的G结构域（G1box-G5box）；两个构象变构域（SwitchⅠ和SwitchⅡ）。C末端具有与异戊二烯化相关的CCX序列，有利于增强Rab蛋白的疏水性并促进C端与细胞膜相连，该序列在Rab小G蛋白调节囊泡运输具有重要的作用（图3）。

BLASTP序列比对结果显示，McRABD2c与黄瓜CsRABD2C-like（XP_004148356.1）同源性高达99%，同川桑MnRABD2C（EXC02066.1）和黄瓜CsYPTM2（XP_004147230.1）具有97%的同源性，同百脉根LjRAB1C（CAA98160.1）和苹果MdRABD2C（XP_

008369210.1）具有96%的同源性，因此推测McRABD2c为苦瓜RABD2C-like小G蛋白家族新成员（图3）。

氨基酸序列McRABD2c与拟南芥小G蛋白家族基因经Mega6 Clustal X聚类分析后，采用Neighbor-joining进行1 000次bootstrap计算，构建系统进化树。结果表明，McRABD2c与拟南芥小G蛋白Rab1进化距离较近（图4）。

2.2.2 苦瓜McAGD8保守结构域及系统进化分析

氨基酸序列分析结果表明：苦瓜McAGD8含有1个Arf GAP结构域，并含有1个C4类型的锌指结构（图2），同时含有保守的CX2CX16CX2C结构域（图5），该结构域能够激活ATP 酶，调节囊泡运输。

BLASTP结果表明，该基因序列同黄瓜CsAGD8-like（XP_004148740.1）具有高达90%的同源性，同甜瓜CmAGD8（XP_008448682.1）具有89%的同源性，同葡萄VvAGD8-like（XP_002278066.2）具有80%的同源性，同大豆GmAGD8-like（XP_003531961.1）具有78%的同源性，同梅子PmAGD8（XP_008238246.1）具有77%的同源性。表明苦瓜McAGD8为苦瓜AGD8-like蛋白家族新成员（图5）。

McAGD8与拟南芥AGD蛋白家族基因经Mega6 Clustal X聚类分析后，采用Neighbor-joining进行1 000次bootstrap计算，构建系统进化树。结果表明，McAGD8与拟南芥AtAGD8蛋白进化距离较近（图6）。

3 讨论与结论

迄今为止在拟南芥中发现的93个小G蛋白中共有57个Rab GTPases[18-19]，是小G蛋白超家族中最大的家族，主要参与囊泡运输、调节蛋白质分泌、细胞信号调控等[20]。含有4个Rab1蛋白（AtRABD2a、AtRABD2b、AtRABD2c、AtRABD1）。同哺乳动物中的Rab1和酵母中的Ypt1具有高度的同源性。已有研究结果表明，动物中Rab1位于内质网及高尔基体的中间舱及高尔基体，调节内质网到高尔基体间的跨膜运输[21-22]；酵母中的YPT1对内质网到高尔基体间的跨膜运输起重要作用[23]；拟南芥中AtRABD2a的显性失活突变体瞬间表达能够将荧光富集在内质网上[24]；拟南芥AtRABD2b同植物生长发育相关，参与花期、衰老及胁迫调节，并参与ABA途径[25]。

本研究中McRABD2c是从苦瓜成熟果实中获得的，是否表明该基因参与了果实成熟过程的调控，与乙烯诱导途径是否相关，是否参与了植物衰老过程及是否与逆境胁迫相关等还有待于进一步研究确认。

所有小G蛋白包括ArfGTPases从激活态（GTP-bound）到非激活态（GDT-bound）之间的循环过程需要下游效应子的调节。调节ArfGTPases的效应子即是ArfGAPs（AGD）。拟南芥含有15个AtAGDs，共分为4组，具有跨膜运输的功能。AGD8为第二组成员，含有1个Arf GAP结构域，并含有1个C4类型的锌指结构，同时含有保守的CX2CX16CX2C结构域[19]。已有研究结果表明该基因位于高尔基体[26-27]，功能作用到目前为止还不清楚。本研究克隆并分析McAGD8基因生物信息，为进一步分析基因功能，并进一步揭示该基因调控细胞生命活动的分子机制提供一定的研究基础。

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