西瓜未受精胚珠离体培养若干影响因素的研究

荣文娟　刘君璞　朱迎春　邓云　李卫华　安国林　李可　孙德玺

摘要：为探讨适宜的西瓜未受精胚珠离体培养方法，以‘大果黑美人、‘早春翠玉、‘中科6号等为试材，研究了供体植株的基因型、4℃预处理时间、35℃高温预培养时间及植物生长调节剂对未受精胚珠的反应率和愈伤诱导率的影响。结果表明：不同材料（基因型）的胚珠反应率和愈伤诱导率都有显著性差异，愈伤诱导率最高的是‘中科6号（92.3%），最低的是野生西瓜‘09005（57.2%）；4℃低温预处理没有显著提高胚珠反应率和愈伤诱导率，对于胚珠反应率和愈伤诱导率的影响因培养基不同而不同；35℃高温预培养可以提高胚珠反应率和愈伤诱导率，预培养3d可以得到较高的愈伤诱导率和质量较好的愈伤组织；在诱导培养基MS+6-BA2mg·L^-1+NAA3mg·L^-1+TDZ0.05mg·L^-1上，愈伤诱导率最高为84.64%；植物生长调节剂TDZ相对于2，4-D和KT对西瓜未受精胚珠愈伤诱导的效果较好。

关键词：西瓜；未受精胚珠；离体培养；愈伤组织；诱导率

西瓜是重要的经济作物，由于遗传基础狭窄，限制了育种工作的进展。传统的育种方法品种创新难度大、费时费力。西瓜单倍体培养有利于性状表达、快速纯合基因型、获得新的种质资源，和传统的育种方法相结合加速育种进程，拓宽了育种途径；也可以用于分子标记、基因定位、遗传图谱构建等，有着极其重要的意义。通过离体诱导雌核发育和雄核发育都可以获得单倍体，在葫芦科作物中，黄瓜、西葫芦、南瓜、甜瓜的离体诱导雌核发育都获得了再生植株。西瓜通过花药离体培养诱导获得愈伤组织的报道较多，愈伤组织的诱导率较高，愈伤组织分化出再生植株的分化率低。周林对西瓜花药和未受精子房离体培养进行了初步研究，也只得到了愈伤组织，没有获得单倍体植株。王建设等研究西瓜未受精胚珠离体培养得到了3个有再生能力的胚，其中的一个胚状体再生出了单倍体植株。李玲等通过对西瓜未授粉子房和胚珠离体培养的研究，获得了愈伤组织，没有获得完整的单倍体植株。基于前人西瓜未受精胚珠离体培养获得单倍体的培养体系还没有建立，体系之中的许多影响因素还未明确，本试验挑取西瓜未受精胚珠为外植体，研究培养过程中的材料的基因型、低温预处理时间、高温预培养时间、激素对未受精胚珠离体培养的影响，为建立西瓜未受精胚珠离体培养获得单倍体的培养体系提供参考。

1.材料和方法

1.1试验材料

未受精胚珠离体培养以‘大果黑美人、‘早春翠玉、‘中科6号等7个杂交种和野生西瓜‘09005为试验材料（表1）。材料在4月份定植于中国农业科学院郑州果树研究所试验地，每份材料定植80株，栽培管理同大田一般管理。开花前1d下午对雌花进行套帽，早上8：00采集未受精的子房用冰盒带回。

1.2方法

1.2.1胚珠离体培养取未授粉的子房，轻轻去掉子房上面的茸毛，参考西瓜花药消毒方法在超净工作台上用75%（φ）的乙醇浸泡子房30s，随后用0.1%的升汞浸泡消毒8min，再用无菌水冲洗4～5遍。把子房放在无菌的培养皿上，用解剖刀切成3mm左右的薄片，用无菌的解剖针挑取胚珠，轻轻放在诱导培养基上（蔗糖浓度为4%，琼脂浓度为0.6%，pH为5.82-5.86）。接种后的培养条件：25℃左右，光照16h·d^-1，光强3000L左右。每个处理接种3皿，每皿接种胚珠25个左右，3次重复。统计每皿接种数、胚珠膨大转绿的胚珠数和长出愈伤组织的胚珠数。

1.2.2低温预处理时间的筛选

以‘中科6号开花当天未受精的胚珠为试材，分别4℃预处理0、1、2、3、4、5、6 d后，接种在1号和2号诱导培养基上，其他培养条件保持一致，统计胚珠反应率和愈伤组织诱导率。

1.2.3高温预培养时间的筛选

以‘中科6号、‘西农8号和野生西瓜‘09005为试材，选择4℃预处理4d的子房，把胚珠接种在1号诱导培养基上，进行0、l、3、5 d高温预培养，其他培养条件保持一致，培养15d查看胚珠生长状况。

1.2.4不同激素种类的筛选

以‘中科6号为试材，接种在添加不同激素的诱导培养基上，统计胚珠反应率和愈伤诱导率，分析激素对未受精胚珠离体培养的影响。

1.3数据处理

试验数据用Excel和SPSS数据处理系统进行分析。

胚珠反应率/%=胚珠膨大转绿的胚珠数/接种数×100；

愈伤诱导率/%=长出愈伤组织的胚珠数/接种数×100。

2.结果和分析

2.1基因型对西瓜未受精胚珠离体培养的影响

把8个不同基因型西瓜的未受精胚珠接种在诱导培养基上，胚珠的表现有显著性差异（表2）。把未受精胚珠接种到诱导培养基上，刚挑取的未受精胚珠比较小，饱满白色（图版-1）；经过35℃高温预培养3d明显膨大发黄，部分会褐化死亡（图版2）；试验中用到的材料胚珠反应率虽有差异，但普遍较高，都在90%以上。胚珠启动发育，明显膨大后，培养5d，胚珠长出少量白色或淡黄色愈伤组织，此时愈伤组织比较疏松（图版-3）。随着培养时间的延长，愈伤组织明显增多，体积迅速膨大，暗培养10d转移到光照条件下，愈伤组织由白色或者淡黄色转为黄绿色、绿色（图版-4），比较疏松的愈伤组织经过继代培养会变得质密。不同的基因型愈伤组织生长状况不一样，野生西瓜‘09005和栽培品种相比愈伤诱导率较低，‘中科6号的愈伤率高达92.30%，而野生西瓜‘09005的愈伤率只有57.20%，两者之间的愈伤质量相差很大。栽培品种诱导出的愈伤大多质地疏松（图版-4），后期培养中易玻璃化，野生西瓜‘09005诱导出的愈伤质地较硬、颜色略白（图版一5），后期培养容易变褐死亡。疏松黄绿色或绿色的愈伤组织在后期培养中可以转变为质地良好的愈伤组织（图版-6）。试验中的栽培品种的愈伤组织经过进一步培养增殖分化，而野生西瓜‘09005的愈伤组织却在培养过程中易死亡，表明基因型对未受精胚珠离体培养的诱导有重要影响。

2.2低温预处理时间对诱导的影响

以‘中科6号为试材进行低温预处理，结果表明：对材料进行低温预处理没有显著提高胚珠的反应率和愈伤诱导率（表3），低温预处理时间对诱导率的影响会因培养基的不同而异。在1号培养基上，低温预处理0-6d对胚珠的反应率和愈伤率的影响没有显著性差异，愈伤率以低温预处理4d最高为44.73%。在2号培养基上，胚珠反应率和愈伤率在低温处理不同时间上有显著性差异。未经过低温预处理的胚珠反应率和愈伤率最高，为80.99%和25.59%，经过低温预处理的胚珠反应率和愈伤诱导率降低。

2.3高温预培养时间对诱导的影响

以‘中科6号、‘西农8号和野生西瓜‘09005为试材，在35℃高温下进行不同时间的预培养，结果表明：高温预培养时间对3种材料的胚珠反应率都没有显著性差异，但对愈伤组织诱导率有显著差异（表4）。‘西农8号高温不同时间之间有显著性差异，随高温预培养时间的延长，愈伤诱导率增高，高温5d愈伤诱导率最高为69.43%。‘中科6号和野生西瓜‘09005高温不同时间之间没有显著性差异，‘中科6号的愈伤诱导率在5d最高为63，99%，野生西瓜‘09005在高温预培养3d时愈伤诱导率最高为52.38%。3种材料对高温预培养的差异性表现也说明基因型在培养过程中起重要作用。胚珠处于35℃二高温条件下培养时，胚珠迅速膨大，愈伤生长快而疏松，后期分化比较难。综合考虑，以35℃高温预培养3d为宜。在培养过程中，胚珠经35℃高温预培养比未经高温预培养膨大转绿所需要的时间短。未经过高温预培养的胚珠一般3d才能看出来稍有膨大，一般5-7d胚珠颜色略为变黄。经过高温预培养的胚珠2d就有所膨大，3d就会变黄。合适的高温预培养时间能增加诱导率，同时也获得质量较好的愈伤组织。

2.4激素对胚珠离体培养的影响

试验对不同激素组合进行了筛选（表5），12号培养基为不添加激素的MS培养基。未受精胚珠在MS培养基上反应率最低为18.12%，且最后都褐化死亡，培养基中添加激素能提高未受精胚珠反应率和愈伤组织诱导率。在相同的6-BA和NAA质量浓度下，2，4-D的质量浓度为1mg·L^-1愈伤率最高（63.07%）；TDZ质量浓度为0.05mg·L^-1时愈伤率最高（84.64%）；KT质量浓度为3mg·L^-1时愈伤率最高（53.95%）。3种激素相比较，诱导未受精胚珠愈伤率的高低顺序是TDZ>2，4-D>KT。

3.讨论

3.1基因型对未受精胚珠的影响

在西葫芦、黄瓜等许多种作物中证明，基因型是影响获得单倍体植株的关键因素。在西瓜上，李玲等做西瓜未受精子房和未受精胚珠离体培养时，认为基因型在培养中起重要作用。刘晓辉做西瓜紫外辐射花粉诱导西瓜单倍体中也证明出胚率、植株再生率和单倍体诱导率受基因型的影响。缑艳霞等研究西瓜花药离体培养认为，供体植株的基因型是影响花药培养的关键因素。基因型对诱导的影响会因作物而异，本试验中选择了8个不同基因型的材料，材料在反应率和愈伤组织诱导率上都有差异，与前人研究结果一致。在研究中可以选择高反应率和愈伤率的材料进行试验，增加诱导成功的可能性。

3.2低温对未受精胚珠的影响

许多未受精子房或胚珠离体培养的研究认为低温预处理有很重要的作用。低温预处理是改变细胞分裂方式和发育途径，提高胚或者愈伤组织诱导率的一种途径。朱迎春等、羊杏平等认为4℃处理2 d能够提高西瓜小孢子的活性。魏瑛认为低温处理可以提高西瓜花药愈伤组织的诱导率，针对不同的基因型进行不同的低温预处理。魏瑛报道在做花药培养时，一段时间低温处理可以抑制花药壁产生愈伤组织；在西瓜未受精离体培养中，诱导出的愈伤组织也可能来源于珠被细胞，需要进一步研究证明愈伤组织的来源，以抑制珠被产生愈伤组织。本试验中用一个材料做了低温预处理，比较了在两种不同的培养基上的反应率和愈伤诱导率，在1号培养基上4℃低温预处理并没有显著提高胚珠的反应率、愈伤组织诱导率，但对愈伤组织的质量有影响；在2号培养基上低温预处理不利于未受精胚珠的发育。因为基因型之间存在差异，4℃低温预处理对不同试验材料的影响也可能不同。低温预处理对西瓜未受精胚珠的影响还需进一步研究。

3.3高温对未受精胚珠的影响

许多研究表明，30℃或35℃黑暗热激可以促进雌核发育，不同的作物热激时间不同。G6mes-Juhfisz A等在黄瓜未受精子房离体培养试验中，比较了24、28、35℃对雌核发育诱导的影响，以35℃热激时胚胎数量最多。本试验中，采用35℃黑暗热激，经过黑暗热激的胚珠反应速度比未经过高温热激的快，愈伤率得到提高，可能是高温促进愈伤的生长。胚珠黑暗热激时间长，会影响愈伤组织质量。高温条件下，愈伤组织生长速度明显加快，但形成的愈伤组织易蓬松、水渍状，继代培养也难以转化为质地好的愈伤。‘中科6号和‘西农8号的愈伤诱导率在5 d最高，但综合考虑生长状况，本试验以35℃黑暗热激3d为宜。

3.4激素对西瓜未受精胚珠离体培养的影响

未受精胚珠接种在不加任何激素的MS基本培养基上，胚珠全部褐化死亡。由未受精胚珠诱导出愈伤组织转接在MS基本培养基上也全部褐化死亡。这说明，激素在西瓜未受精胚珠离体培养诱导过程中起关键作用。许多研究者认为，一定浓度的2，4-D对诱导十分必要，试验中诱导培养基添加一定浓度的2，4-D能够明显提高愈伤组织的诱导率，但是添加一定浓度的TDZ和2，4-D相比更利于诱导出愈伤组织。最佳愈伤诱导培养基为MS+6-BA2mg·L^-1%NAA3mg·L^-1+TDZ0.05mg·L^-1，诱导出的愈伤组织转接到6-BA2mg·L^-1+NAA2mg·L^-1+KT2mg·L^-1的培养基上，愈伤生长状况良好。

取材时间、基因型、温度变化、培养基等许多因素影响西瓜未受精胚珠离体培养，这些因素之间的作用不是独立的，只使其中的一个条件达到最优，再和其他影响因素相互作用不一定能建立最适合西瓜未受精胚珠离体培养的体系。西瓜未受精胚珠的离体培养，由于取材的限制和培养过程漫长、重复性差等特点，所以研究过程相对缓慢。西瓜未受精胚珠离体培养时产生愈伤组织或者胚状体是获得单倍体植株的有效途径，一般试验中愈伤组织更易获得，但培养中体细胞也有可能脱分化形成愈伤组织，所以如何抑制体细胞产生愈伤也是诱导成功的关键。在黄瓜、西葫芦等作物的单倍体培养中，已经建立了比较完整稳定的培养体系，而西瓜单倍体培养体系还在探索阶段，需进一步的研究。