分子标记技术在辣椒种子纯度检测中的应用

杨中周

摘要：种子的纯度是种子质量的重要指标，其对产量及品质均有直接而明显的影响。辣椒种子纯度鉴定技术也由传统的主要依赖形态鉴定逐步发展形成集形态学鉴定、细胞学鉴定、蛋白及同工酶电泳鉴定和遗传标记鉴定等技术的鉴定技术体系，特别是基于DNA水平的分子标记技术为种子纯度鉴定提供了一个新的途径。对用于辣椒纯度鉴定的几种分子标记技术的基本原理及应用进行了概述，并全面阐述了各自的优缺点，主要包括RFLP、RAPD、SCAR、SSR、ISSR、SRAP、SNP，旨在为辣椒分子纯度鉴定提供参考。

关键词：辣椒；纯度检测；SSR；ISSR；SNP

近年我国辣椒种植面积有130万hm²之多，仅次于白菜类蔬菜；每年辣椒产量高达2800万t，总产值居蔬菜之首。在当今辣椒生产中广泛使用杂交种，而在实际的制种过程中，由于父母本混杂、母本自交、外来花粉干扰等均影响到种子纯度进而影响辣椒的品质与产量。传统的种子纯度鉴定主要以田间植株的叶形、长势、幼果鉴定为主，辅以苗期真叶POD同工酶电泳等方式。前者耗时较长，投入成本较高，而且还常受天气等因素制约；后者虽然受外界因素影响小，鉴定准确可靠，但其谱带少，差异有限，不能够显示出不同品种基因型间的差异。自1974年，Grodzicker等发明了RFLP（Re—striction Fragment Length Polymorphism，限带性内切酶片段长度多态性）技术以来，迄今已有20多种分子标记技术相继问世，部分已应用于农作物纯度的检测中。

1.限制性酶结合使用分子杂交技术的标记

1.1RELP（Restriction fragment length polymor-phism，限制性内切酶片段长度多态性）技术

这种基于酶切最早用于品种鉴定的第一代分子标记技术，主要通过DNA提取、限制性内切酶切割、琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳、southerri印迹杂交、放射自显影、与标准RFLP指纹比较分析等几个步骤对品种进行验杂。RFLP标记大多为共显性标记，具有特异性强、准确性高等优点。Livneh等认为，RFLP技术可用于鉴别辣椒杂交种及其亲本的种子和幼苗形态（而同工酶不能鉴别），如利用Hind III/Riho探针43可将杂种Capsicum annuum及其亲本鉴别开来。然而其技术操作繁琐、难度较大、耗费高，不适合大规模的商业鉴定，因此2年后Livneh等又将其改造成一个简单适用的PCR反应。该项技术的诸多缺点极大地限制了其在种子纯度鉴定中的应用。

2.经PCR扩增的标记

2.1RAPD标记（Randomly Amplified Polymor-phic DNA，随机扩增多态性DNA）

该技术是以PCR（Polymerase Chain Reaction，聚合酶链式反应）为基础，以长度为9～10bp随机寡聚核苷酸为引物对模板DNA进行PCR扩增，后经琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳、溴化乙锭（EB）或银染鉴定多态性。该技术在辣椒杂种鉴定中的研究较为普遍，詹玉丝等研究PCR反应的主要影响因子，建立适合辣椒RAPD分析的PCR反应体系，并用40个引物对‘豫椒968及其亲本进行PCR扩增检测，筛选出S5、S149、S187等3个有特异性的引物。在对以上3个引物进行重复筛选后，确定S149能用于此辣椒品种纯度鉴定，用该引物扩增、电泳鉴定结果与田间鉴定结果完全吻合。柳李旺等用91个寡核苷随机引物扩增‘02-16及其亲本，但亲本与杂交后代间差异不明显，但通过引入外来品种，发现外来种与‘02-16有明显区别，确定此类引物可以鉴定外来品种引起的机械混杂。经筛选引物N5能在父母本之间扩增出的特异带存在着明显区别，认为该引物可用于鉴定真杂种和由于母本自交引起的假杂种及外来品种的机械混杂。用该引物对代纯度鉴定与田间鉴定、种子贮藏蛋白质鉴定、苗期真叶POD同工酶分析结果基本一致。李智军等针对‘广椒6号及亲本，从340个RAPD随机引物中筛选出用于反交种的纯度鉴定的偏母型引物5个，用于正交种鉴定的偏父型引物4个，可用于正反交种两者纯度检测的互补型引物6个。利用偏父型引物F05、105和互补型引物F15进行纯度检测，3个引物的检测结果不但一致，而且与田间形态学鉴定结果吻合。黄三文等筛选出12个可用于‘中椒系列杂交种纯度鉴定的RAPD标记。Hulya的研究也证实RAPD标记在辣椒纯度鉴定中的可行性。但由于RAPD受条件影响大，重复性差，而且一般只表现显性遗传，不能有效区分显性纯合和杂合基因型等缺点，直接限制了其的发展。

2.2SSR标记（Simple Sequence Repeat或Micro-satellite DNA，微卫星DNA）

它是由多为1～6个核苷酸串联重复成100bp以内大小的DNA片段。由于微卫星位点两侧的碱基序列较为保守，便于设计特定的引物，经体外扩增后的产物通过电泳技术进行分离，进而获取这些重复序列的多态性信息。SSR标记多态性高、结果重演性和稳定性好、操作高度自动化、不受环境影响、每个位点均有许多等位形式，且呈共显性遗传，与显性遗传相比，它可分辨出杂交种子的杂合体和纯合体，是目前应用最为广泛的分子标记技术，同时也是被普遍认为是最接近理想化的品种鉴定技术。特别是自2010年我国应用SSR分子标记开展品种真实性监督抽查以来，越来越多的仲裁机构依靠该技术进行纯度检测，这也促使许多企业争相效仿。

刘子记等从辣椒85对SSR引物中筛选出10对位于不同染色体上、能在‘热辣3号亲本间能扩增出互补特异性条带的引物，且均为共显性标记；然后用分别位于2、10、11号染色体上的多态性标记SSR27、SSR70、SSR76对196株‘热辣3号单株及其亲本材料进行PCR扩增，从扩增结果检测其纯度。该检测结果与田间表型鉴定结果高度一致，表明SSR分子标记可用于‘热辣3号杂交种纯度的快速鉴定。张曼利用21对SSR引物对辣椒代及其双亲进行PCR扩增筛选，发现引物CA885在双亲和F₁代中存在多态性。且该引物扩增结果稳定。利用CA885分别对2份辣椒品种F₁杂交种的96株单株进行纯度检测，结果分别为90.6%和86.0%。与田间纯度检测结果（分别为90.6%和91.3%）相近或稍低。

2.3SCAR（Sequence Characterized Amplified Regions，特定性片段扩增区域）标记

该技术于1993年由Paran和Michelmore在RAPD基础上提出，其稳定性和可重复性显著提高，还具有快速、准确、成本低的特点，为品种分类与鉴定、假种辨别提供技术依据。陈灵芝等利用150条随机引物对‘陇椒5号及其亲本基因组DNA进行扩增，筛选出R520和R780两条特异性引物，前者为父本和F₁特有标记，后者为母本和F₁特有标记。对可鉴别母本和F₁的R520扩增片段进行回收、克隆、测序，设计合成一对引物对试材进行扩增，鉴定出无条带的母本或杂株。

2.4ISSR（Inter Simple Sequence Repeat，简单序列重复区间扩增多态性）分子标记技术

该技术是由Zietkeiwitcz等于1994年基于SSR开发的、利用引物（SSR序列的3'端或5'端锚定1至数个随机核苷酸）对位于反向排列、间隔不太大的重复序列间的基因组节段进行PCR扩增的一种分子标记。该技术遗传多态性高、重复性好、DNA用量少、无需知道两端的碱基序列，引物设计简单、呈孟德尔遗传，已被广泛应用于种质鉴定，然而其在辣椒上的研究鲜有报道。徐杰从15条引物中筛选出10条重复性好、条带清晰、多态性好的引物，并利用优化后的ISSR-PCR反应体系对辣椒F₁代种子的DNA进行扩增，电泳图谱结果表明，ISSR可以有效地从F₁种中分离出机械混杂或人工混杂的种子。然而该试验未对F₁的亲本DNA同时进行扩增分析，也未对结果进行后续田间验证，因而未区分出真假杂交种和验证结果的真实性。

2.5SRAP标记（Sequence-Related AmplifiedPolymorphism，相关序列扩增多态性）

该技术由美国加州大学Li博士等于2001年开发出的基于PCR对基因的ORFs（0pen Readinz Frames，开放阅读框）的特定区域进行扩增的一种显性分子标记技术。SRAP的一组由17个碱基组成的正向引物中使用“CCGG”序列，其目的是使之特异结合可译框（ORFS）区域中的外显子；SRAP中使用的由18个碱基组成的反向引物的3'端含有核心AATT，以特异结合富含AT区，比如启动子和内含子等。这就使得内含子与外显子有可能得到扩增。SRAP具有多态性丰富、引物可以通用等特点，与SSR相比其辨别能力更高、鉴定结果更接近田间种质鉴定，是一种高效的作物品种尤其是杂交种鉴定技术。扈新民等对SRAP分子标记反应体系进行优化，确定最佳反应体系，并以‘杭椒4号及其父母本为供试材料检测杂种一代纯度，结果与田间农艺性状调查验证结果非常接近。

3.基于单核苷酸多态性（Single Nugle-otide PolymorphiSill，SNP）的分子标记

自1996年Lande首次将SNP作为一种新型分子标记提出，该技术越来越受到国内外学者的重视，目前已经成为最具应用前景的分子标记。SNP标记主要是由单碱基的插入、缺失、转换及调换等引起的基因组核苷酸序列多态性，具有二态性、等位基因性、密度高、遗传稳定、易实现分析的自动化等特点。Jung等筛选出可以用于辣椒品种鉴定的40个AS-PCR SNP标记，从而将81个商品种中的79个区分开来，同时也能完全区分出供试的17个甜椒品种。Jeong等俐用SNP-HRM技术对辣椒属6个种的31个成员进行辣椒种质资源研究，发现通过对6种COSII标记曲线的结合比较分析可有效将他们归到其所属的种，这与当今的分类系统完全吻合，从而表明该项技术可快速鉴别新种质。这些科研成果对鉴定外来品种的机械混杂具有一定的借鉴意义，然而应用该项技术对辣椒真杂种和由于母本自交引起的假杂种的鉴定鲜有报道。国内外该项技术的研究虽仅限于西瓜、甜瓜与黄瓜，然而这些宝贵的经验却为判断辣椒种子是否存在亲本污染，进而测试出供试品种的种子纯度的相关研究创造了条件。

4.应用前景与展望

理想的纯度检测方法应具备稳定性好、技术简单、快速、经济、便于标准化操作等特点。而就目前常用的几种分子标记而言，RFLP操作复杂，对DNA质量要求高，费用较高，放射性同位素对人体有害；RAPD结果重复性较差；SSR引物开发费用高；SNP存在专利问题，对遗传统计的方法及工具要求高，开发、检测费用大等。均未达到理想的检测方法的要求。

2014年1月韩国首尔大学的Kim等对墨西哥一个辣椒栽培变种的全基因组序列和装配进行了报道，并报道了2个栽培辣椒基因序列及一个野生黄灯笼椒从头测序序列；在此基础上获得首个高质量的参考基因组，并锁定了负责产生辣椒素的基因。同年3月Qin等报道了遵义市农业科学研究院选育的品种‘遵辣1号和一个墨西哥野生种的全基因组序列。这些在辣椒领域的科研进展将会促使SSR引物开发费用逐渐降低。就ISSR标记而言，其引物具有良好通用性，引物设计费用低。此外，两者兼具操作简单、稳定性好等特点，使其基本满足辣椒纯度检测的要求。

近年来，公共序列数据库（NCBI）中大量快速增长的EST（Expressed Sequence Tags，表达序列标签）序列资源与辣椒多态性EST-SSR标记的位点鉴定及引物研究为SSR标记的开发提供了新途径。目前EST-SSR分子标记技术已在南瓜、黄瓜、大白菜等作物纯度鉴定上成功应用。该项技术具有过程简单、成本低、在相关物种间具有较高的可转移性等特点，再加上SSR位点在转录区的发生频率远高于非转录区的优势，使得该项技术更高效，有较好的应用前景。同时随着高通量测序技术和生物信息学的发展，海量SNP数据被提交至数据库并共享，为建立精确、快速、高通量和高度自动化的辣椒种子纯度SNP鉴定体系创造了条件。

在实际工作中，往往要等到供试材料长出叶片后再进行提取，而且采用不同的方法（商业DNA提取试剂盒、CTAB法、SDS法以及其改良后的一些方法）提取的速度及质量也略有差异。这些都是制约鉴定效率的重要因素。如果能从干辣椒种子中快速提取DNA并形成标准化的操作流程和技术体系，这将大大缩短鉴定所需时间，提高工作效率。