聚乙二醇单甲醚接枝壳聚糖取代度测定方法与分析

杨心督 张其清

壳聚糖是甲壳素脱乙酰基的产物，也是生物界唯一的一种碱性多糖。壳聚糖分子中还有多个乙酰己糖胺残基，在分子间能够形成氢键，导致壳聚糖不溶于水和其他有机溶剂，限制了其应用范围。聚乙二醇能够增加赋予材料新的特性和功能，如亲水性，柔性以及抗巨噬细胞吞噬等性能。近年来，国内外对聚乙二醇改性壳聚糖衍生物的研究相当广泛，目前主要应用于纳米药物载体［1］、基因治疗［2］以及温敏性凝胶［3］等领域的研究和开发。我们已报道采用甲醛连接法合成了聚乙二醇接枝壳聚糖材料，但目前对聚乙二醇单甲醚接枝壳聚糖的取代度测定方法较多，原理各异，鲜有文献对不同测定方法进行研究。为测定聚乙二醇接枝壳聚糖的取代程度，本研究对相关测定方法进行了探讨和分析，报道如下。

1 仪器及样品

核磁共振谱仪(500 MHz，VARINA INOVA)，聚乙二醇单甲醚接枝壳聚糖(实验室自制)，聚乙烯醇硫酸钾(PVSK，上海紫一试剂厂)，甲苯胺蓝(sigma 公司)，其它试剂为分析纯。

2 实验方法

通过改变聚乙二醇单甲醚与壳聚糖投料比化学合成三种不同取代程度的聚乙二醇单甲醚接枝壳聚糖样品。分别采用胶体滴定法和核磁共振谱法对三批样品进行取代程度测定，对结果进行汇总分析。

2.1 胶体滴定测定法 将已经干燥恒重的聚乙二醇单甲醚接枝壳聚糖样品溶于25 ml 去离子水，配制成0.02%的样品溶液，准确量取5 ml 置于锥形瓶，加入0.2 mol/L 的盐酸溶液2 ml 和甲苯胺蓝指示剂一滴，摇匀，采用已标定的标准聚乙烯醇硫酸钾溶液进行滴定，以溶液颜色由蓝色变为亮紫色为滴定终点，并进行空白对照。按照以下公式计算聚乙二醇单甲醚接枝壳聚糖的氨基含量(NH2%)。

其中:CN 为标定的聚乙烯醇硫酸钾的浓度(mmol/L);M 为壳聚糖链节相对分子质量;C 为样品溶液的浓度(g/ml);V 为滴定体积(ml);V0 为空白滴定体积(ml)。

采用上述方法，同时测定壳聚糖的氨基含量(NH2%)，并进行空白对照。按照以下公式计算聚乙二醇单甲醚接枝壳聚糖的取代度(DS)。

DS = 聚乙二醇单甲醚接枝壳聚糖氨基含量(NH2%)-壳聚糖氨基含量(NH2%)。

2.2 核磁共振谱法 采用VARINA INOVA 500 MHz型核磁共振仪，以D2O/CH3COOD 为溶剂，测定接枝壳聚糖的核磁共振图谱。

图1 聚乙二醇单甲醚接枝壳聚糖核磁共振谱

如图1 显示，δ2.90为壳聚糖2 位氢信号，δ3.22为聚乙二醇单甲醚中甲氧基氢信号，采用δ2.90与δ3.2的峰面积比值来计算得到聚乙二醇单甲醚接枝壳聚糖的取代度。

其中:DS 为聚乙二醇单甲醚接枝壳聚糖的取代度，I3.22ppm和I2.90ppm为δ2.90和δ3.22的峰面积。

3 测定结果

通过胶体滴定法和核磁共振谱法对不同取代度的聚乙二醇单甲醚接枝壳聚糖均可测定，其中，胶体滴定法属于间接方法，核磁共振谱法属于直接方法。见表1。

表1 聚乙二醇单甲醚接枝壳聚糖取代度测定结果表

两种不同方法测定结果进行比较，胶体滴定法和核磁共振法测定的取代程度数值存有差异，但从取代程度的趋势上看，随着投料比例的增加，取代度逐渐增大。见图2。

图2 不同方法测定聚乙二醇单甲醚接枝壳聚糖取代度情况图

4 讨论

高分子多糖通常是多种不同分子量多糖的集合，分子量分布比较宽泛，分子的链长也存在较大差异，难以将分子量及链节的取代程度进行精确测定，一般涞水，高分子的分子量及链节的取代程度的测定值均为平均值。聚乙二醇接枝壳聚糖是一种改性的高分子多糖，目前，对聚乙二醇接枝壳聚糖的取代度的测定方法众说纷纭，常用方法主要包括称重法、元素分析法、红外光谱法、胶体滴定法以及核磁共振谱法等，称重法、元素分析法以及红外光谱法对样品的需求量大，一般要求较高，每种方法都存在一定的局限性。

本研究通过采用胶体滴定法和核磁共振谱法分别测定了聚乙二醇接枝壳聚糖的取代度，比较分析了两种方法测定结果的差异。从测定结果看，两种测定方法随着投料比不断增加，取代度不断增大的趋势基本一致，但测定数值存有差异，造成差异的原因主要包括以下两个方面:一是测定数值的含义不同，核磁共振法测定的聚乙二醇单甲醚的取代程度为摩尔百分含量，胶体滴定法测定的取代程度为质量百分含量;二是测定原理有所不同，胶体滴定法是对带电基团进行容量分析，以指示剂颜色变化作为指示终点，测定过程及结果容易受到pH 值、浓度、滴定速度和离子强度等影响［4］。此外，由于胶体滴定法测定时需要对壳聚糖和聚乙二醇接枝壳聚糖进行同时测定后才能计算聚乙二醇壳聚糖的取代程度，属于间接测定方法。当聚乙二醇单甲醚与壳聚糖的取代度较高时，由于聚乙二醇单甲醚具有亲水性、柔性，聚乙二醇单甲醚会对聚乙烯醇硫酸钾产生分子位阻，在氨基葡萄糖周围形成保护云，使得聚乙烯醇硫酸钾难以及时与壳聚糖氨基的正电荷发生反应，而提前与甲苯胺蓝反应，导致指示终点提前，因此，采用胶体滴定测定时，对取代度高的样品采用该方法对测定结果影响较大。定量核磁共振谱法测定原理主要是利用聚乙二醇单甲醚的甲氧基和壳聚糖氨基葡萄糖上的氢的积分面积比值来确定取代程度，只需测定聚乙二醇单甲醚接枝壳聚糖样品即可，属于直接测定方法，但由于壳聚糖氨基葡萄糖单元上氢的核磁共振的强度较弱，聚乙二醇单甲醚甲氧基的化学位移和壳聚糖2 位氨基的化学位移在核磁共振谱中比较接近，测定时需对两者实现有效分离，并且图谱容易分辨，对仪器和样品的要求都高。此外，聚乙二醇单甲醚的取代度较高时，其甲氧基的核磁共振信号更强，而壳聚糖氨基葡萄糖单元上氢的核磁共振强度较弱，通过两者的积分面积比值计算取代程度可能会造成测定结果偏高。此外，由于在样品的合成过程中需要不断调整反应条件，需要在合成过程中监测样品的取代程度，而核磁共振谱法对样品要求也较高，核磁共振仪器设备较为昂贵，给样品检测带来了不便，采用胶体滴定法测定方法相对简单，合成过程中可随时监测，比较适用于合成过程中样品取代度的检测。综合以上分析，两种测定方法各有优劣，必要时可通过两种方法测定后进行验证，以防止出现偏倚。

1 Li HL，He YX，Gao QH，et al.Folatepolyethylene glycol conjugated carboxymethyl chitosan for tumortargeted delivery of 5fluorouracil Molecular Medicine Reports，2014，9:786-792.

2 Meenakshi M，Tomaro-Duchesneau C，Saha S，et al.Development and characterization of chitosan-PEG-TAT nanoparticles for the intracellular delivery of siRNA International Journal of Nanomedicine，2013，8:2041-2052

3 Termsarasab D，In-Soo Y，Ju-Hwan P，et al.Polyethylene glycol-modified arachidyl chitosan-based nanoparticles for prolonged blood circulation of doxorubicin International Journal of Pharmaceutics，2014，464 :127-134.

4 Mocchiutti P，Zanuttini MA.Key considerations in the determination of polyelectrolyte concentration by the colloidal titration method.Bioresources，2007，2:399-407.