早期自然流产绒毛外滋养细胞VEGF 的表达及意义

杨倩 卢丽莉 梁珊 毕秀霞 韩彦洁 宋春红 刘洋

在妊娠早期，滋养细胞发育和分化为构成绒毛的滋养细胞(合体滋养细胞和细胞滋养细胞)及绒毛外滋养细胞(extravillous trophoblast，EVT)。EVT 增殖侵入蜕膜组织，具有类似肿瘤的增殖浸润能力［1］。其中，浸入子宫蜕膜间质甚至浅肌层的称绒毛外中间滋养细胞(interstitial extravillous trophoblast，IET)，侵入母体血管的绒毛外滋养细胞称为血管滋养细胞(endovascular extravillous trophoblast，ET)。EVT 以旁分泌，自分泌的方式受滋养细胞及子宫分泌的多种激素及细胞因子的调节，对母体-胎儿血液循环的建立和维持正常妊娠起着至关重要的作用。研究显示，血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是高效的促有丝分裂因子，除了促进子宫内膜和蜕膜组织中血管形成和发育的重要作用［2，3］外，VEGF 还具有增加体外培养的EVT 增殖力的作用［4］。关于流产时外周血及绒毛VEGF 的表达研究［5，6］较多，但绒毛外滋养细胞VEGF 的表达是否发生变化笔者在国内外尚未见报道。因此本实验通过观察自然流产绒毛外滋养细胞VEGF 表达的变化探讨早期自然流产可能的发生机制，为早期自然流产时VEGF 的表达改变提供佐证，探讨自然流产治疗的新方向。

1 资料与方法

1.1 一般资料 流产组:2013 年3 月至2014 年3 月期间在石家庄市第四医院门诊或住院患者，妊娠7 ～9 周，选择经B 超检查诊断为胚胎在宫内死亡尚未自然排出且病因不明(夫妻双方与流产有关的检查均正常)者，共20 例。对照组:同期在我院门诊自愿要求行人工流产的健康女性20 例，均无死胎、死产、自然流产史，本次妊娠期间无先兆流产的症状和体征，B 超检查提示胚胎发育正常，无用药、病毒感染以及X 线接触史。2 组年龄及孕周均无统计学意义(P ＞0.05)。

1.2 标本的采集及处理 2 组均采用可视人工流产手术，从刮出物中取绒毛及绒毛种植部位蜕膜组织(底蜕膜)，0.9%氯化钠溶液漂洗后，置于10%中性甲醛溶液中固定6 ～12 h，梯度乙醇脱水后石蜡包埋，5 μm切片。

1.3 HE 染色及底蜕膜的辨别 在HE 染色切片下观察底蜕膜组织中的绒毛外滋养细胞是无清晰边界的多角形细胞，含丰富的双染性胞质，核深染，不规则，具有轻度多形性。蜕膜细胞具有清晰的细胞膜，轻度嗜伊红的胞质和卵圆形的细胞核。当两者鉴别困难时，加用免疫组化染色CK 和HPL 加以鉴别。选取有底蜕膜成分的腊块，切片进行免疫组化检测。

1.4 免疫组织化学染色 所用一抗为兔抗人VEGF多克隆抗体购自福州迈新生物技术开发公司，运用SP 法检测两组底蜕膜及绒毛组织VEGF 的表达。免疫组化检测试剂盒(SP-9001)和DAB 酶底物显色试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司。操作严格按免疫组化检测试剂盒说明书要求进行，DAB 显色，苏木精复染。阴性对照以PBS 代替一抗进行。

1.5 结果判断标准 采用双盲法在显微镜下(10 ×10)观察中间滋养细胞及血管内着色情况，以细胞内出现棕黄色颗粒为VEGF 表达阳性，每张切片随机观察10 个视野。免疫组化染色结果采用半定量“Quickscore”法［7］判读，细胞染色强度:0 =阴性;1 =弱阳性;2 =中等程度阳性;3 =强阳性;细胞染色密度:1 =0 ～25%;2 ＞ =25 ～50%;3 ＞ = 50 ～75%;4 ＞ =75 ～100%。细胞染色强度和密度的得分相乘再相加得到0 ～12 分的变化范围。

1.6 统计学分析 应用SPSS 18.0 统计软件，计量资料以± s 表示，进行单因素方差分析(One-Way ANOVA)和t 检验，P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

自然流产组VEGF 表达较对照组降低，表现为免疫反应积分(IRS)明显减少(P ＜0.05)。见表1。

3 讨论

成功的妊娠是子宫内膜蜕膜化、胎盘形成和胚胎发育三方面协同作用的结果。胎盘着床及胎盘绒毛的正常发育对于母体－胎儿循环的建立至关重要，胚胎的EVT 侵入母体的蜕膜组织是影响胎盘着床及发育的重要环节之一［1］，EVT 在妊娠早期主要位于胎盘着床部位，为提供足够的营养物质和氧气给胎盘及胎儿，EVT 侵入子宫蜕膜组织和浅肌层形成中间滋养细胞，还有一部分EVT 侵入子宫螺旋动脉，引起螺旋动脉管壁结构改建［3］(管腔扩张，管壁通透性增高，管壁肌性结构消失及纤维蛋白沉积等)，使子宫动脉压力降低并富于血运，从而供应日益增长的胎盘及胎儿的营养需要。EVT 增殖，迁移及侵入蜕膜及血管的过程受很多局部信号分子的调节，包括各种亚型的VEGF、血管紧张素家族(Ang-1，Ang-2)，TGF-b，肝细胞生长因子及干扰素等。其中，VEGF 是最强的血管生成促进因子，它具有促进血管内皮细胞分裂，诱导新生毛细血管形成及增加血管通透性等重要作用［2，3］，因此广泛参与了胚胎发育、器官形成、肿瘤发生等一系列生理病理过程［3，8，9］。研究表明，生理妊娠时，VEGF 广泛表达于蜕膜、绒毛组织及子宫内膜腺体［5，10］，表明VEGF 在生理妊娠及胚胎发育中发挥了重要作用［1，5］。Schiessl等［5］的研究表明，妊娠早期EVT 存在VEGF 及其受体flt-1 的表达。我们的研究显示，人工流产女性(对照组)绒毛外滋养细胞VEGF 免疫组化染色阳性，即EVT 表达VEGF，与Schiessl 等［5］的研究结果是一致的。造成这种差异的原因可能与妊娠不同时相表达VEGF 亚型不同和所用的VEGF 免疫组化抗体的不同有关，Schiessl 发现，VEGF 存在不同的亚型(VEGF-A，C，D)。随妊娠周数的增加，EVT 表达的VEGF 亚型也发生变化［5］。可能由于所用的不同免疫抗体针对亚型抗原决定簇的不同，使得在妊娠早期EVT 表达VEGF 的实验结果出现了差异。

表1 IRS 比较 n =20， ± s

表1 IRS 比较 n =20， ± s

注:与对照组比较，* P ＜0.05

IRS对照组组别7.75 ±2.25自然流产组 5.25 ±1.98*

自然流产发生率较高，是妇产科常见的病理性妊娠之一，其病因涉及染色体、内分泌和免疫异常等诸多因素，尚有部分自然流产病因不清。自然流产及复发性流产时，患者血清及绒毛组织VEGF 表达水平的研究较多［6，11］，且研究结果存在较大差异，造成这种差异的原因不明，而早期自然流产时底蜕膜组织中绒毛外滋养细胞VEGF 的表达国内外尚未见报道。本实验通过免疫组化染色法发现，自然流产患者底蜕膜组织EVT(包括中间滋养细胞和血管滋养细胞)VEGF 表达与正常对照组相比是降低的，可能通过如下机制参与了自然流产的发生:(1)正常对照组EVT 表达VEGF及Flt-1 的表达模式说明IET 通过旁分泌和自分泌VEGF 的方式受到VEGF 作用，研究表明，VEGF 具有增加培养的绒毛外滋养细胞增殖力的作用［4］，EVT 表达VEGF 减少，可能抑制了EVT 的增殖活性，使发育中的EVT 数量不同程度减少，胎盘对子宫内膜的锚定作用和营养吸收功能减弱;(2)ET 分泌VEGF 减少，ET 向螺旋小动脉侵入的过程受挫，抑制了子宫螺旋动脉的生理性转化，子宫螺旋动脉不能适时扩张，子宫血循环压力未能及时下降，影响了母胎交界的营养交换;(3)自然流产时，子宫处在相对缺氧的环境中，VEGF在体外的绒毛膜癌细胞系BeWo 通过激活Nrf2 途径减少氧化损伤，VEGF 的表达下降，使得EVT 耐受缺氧应激的能力下降，EVT 结构和功能受损;当上述机制累积到一定程度最终使得流产难免发生。综上所述，EVT 表达VEGF 水平的下降可能促进了自然流产的发生。在妊娠早期，如能选择性的增加VEGF 的表达或开发激活EVT 的药物，可能为自然流产的治疗提供新的途径。

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