阿莫西林混悬注射液在猪体内的生物等效性研究

潘 娟，严 凤，顾 欣

（上海市兽药饲料检测所，上海201103）

阿莫西林混悬注射液在猪体内的生物等效性研究

潘 娟，严 凤，顾 欣

（上海市兽药饲料检测所，上海201103）

为了研究阿莫西林混悬注射液在猪体内的药代动力学和生物等效性，采用双处理、双周期随机交叉试验设计，将24头健康猪随机分成2组，按15 mg／kg体重肌肉分别单剂量注射受试制剂和参比制剂，采用高效液相色谱法测定血浆中阿莫西林的浓度，利用WinNonlin6.4软件计算主要药动学参数，并评价两种制剂的生物等效性。结果显示，受试制剂和参比制剂的Tmax分别为（3.45±2.49）h，（1.34±1.74）h；Cmax分别为（6.94±4.73）mg／L，（4.39±2.87）mg／L；AUC0－t分别为（37.00±11.48）mg·h·L－1，（30.02±8.93）mg·h·L－1；AUC0－∞分别为（40.26±13.36）mg·h·L－1，（38.46±15.38）mg·h·L－1。阿莫西林混悬注射液受试制剂和参比制剂的AUC0－t、AUC0－∞、Cmax、Tmax均有显著性差异，双单侧t检验结果显示两种制剂生物不等效，试验为兽医临床给药方案的制定以及合理用药提供参考。

阿莫西林混悬注射液；高效液相色谱法；药代动力学；生物等效性

阿莫西林（Amoxicillin，AMO）又称羟氨苄青霉素，是半合成广谱青霉素类抗生素，其性质稳定、耐酸，在胃酸中稳定、吸收迅速、分布广泛，同时又具有杀菌作用较强、副作用较少、剂型多样、与其他药物联用方便和价格便宜等优点，广泛用于兽医临床［1－2］。本试验以猪为研究对象，通过对猪血浆中阿莫西林HPLC测定方法的建立，研究了两种阿莫西林混悬注射液的生物等效性，为兽医临床合理使用阿莫西林混悬注射液提供参考。

1 材料

1.1 药品与试剂 阿莫西林对照品，Dr Ehrenstorfer GmbH，99.5%，批号81023；受试制剂，阿莫西林注射液，A厂，规格100 mL∶15 g，批号140702；参比制剂，阿莫西林注射液，硕腾（上海）动物保健品有限公司，规格100 mL∶15 g，批号36921101；甲醇，色谱纯，Merck公司；去离子水；其它试剂均为分析纯。

1.2 仪器设备 高效液相色谱仪（Waters公司，Acquity UPLC配PDA紫外检测器）、涡旋混合仪（IKA公司，MS3 basic）、氮气吹干（Organomation Associates，Jnc.公司，N－EVAP112）、固相小柱（Waters公司，Oasis HLB，1cc／30mg）、WinNonlin6.4数据处理软件（北京创腾科技有限公司）。

1.3 试验动物 随机挑选健康杜长大三元杂交猪24头，90日龄，体重45 kg左右，雌雄各半，上海种猪测定中心，自由饮水，饲喂不含药物的饲料，每天定时给料2次。给药前饲喂1周，适应环境。

2 方法

2.1 血浆中阿莫西林测定方法的建立

2.1.1 色谱条件 色谱柱为Phenomenex Kinetex XB－C18（100 mm×2.1 mm，2.6 μm），流动相为0.1%盐酸溶液（A）、甲醇（B），线性梯度洗脱［A－B：0 min（90∶10）→4 min（90∶10）→4.2 min（10∶90）→5 min（10∶90）→5.2 min（90∶10）→7 min（90∶10）］，流速为1 mL／min，柱温35℃，进样量10 μL，检测器为二极管阵列检测器，检测波长220 nm。

2.1.2 标准曲线的制备 取阿莫西林对照品适量，置10 mL量瓶中，用甲醇溶解并定容，制得阿莫西林浓度为10 mg／mL的贮备液，置4℃冰箱保存备用。取空白血浆400 μL，加入系列浓度对照品溶液10 μL，配成浓度为0.2、0.5、1、5、10和20 μg／mL的标准血浆样品。再分别向各血浆标准液加入600 μL 5%高氯酸溶液，涡旋2 min，24000 r／min离心5 min，上清液备用。HBL小柱依次用2 mL甲醇，2 mL水活化，取上清液全部过柱，用2 mL水淋洗，抽干。用5 mL甲醇洗脱，收集洗脱液，于40℃氮气吹干，用400 μL 5%甲醇溶液溶解，过0.2 μm有机膜过滤后，HPLC测定。以对照品浓度C为横坐标，对照品峰面积A为纵坐标，用最小二乘法（W＝1／C2）进行回归计算，求得直线回归方程，建立标准曲线。

2.1.3 检测限和定量限 取5个空白血浆样品，按2.1.2项下方法处理，测得基线噪音值，根据农业部试验规范要求，按信噪比S／N＝3为检测限（LOD），S／N＝10为定量限（LOQ）。

2.1.4 专属性考察 将空白血浆样品、一定浓度的对照品溶液加入空白血浆制的血浆样品和给药后的3 h血浆样品，按2.1.2项下方法操作处理后进行测定。

2.1.5 精密度和回收率 取空白血浆400 μL，加入阿莫西林标准工作液，制成低、中、高3个质量浓度（0.2、1、20 μg／mL）的血浆样品，每一浓度6个样品并测定，按2.1.2项下方法处理后进行测定，以测定值与加入值之比计算回收率，并计算批内精密度。连续3 d配制并测定阿莫西林浓度，考察批间精密度。

2.1.6 稳定性考察 取空白血浆400 μL，加入阿莫西林标准工作液，制成低、中、高3个质量浓度（0.2、1、20 μg／mL）的血浆样品，每一浓度6个样品，在室温放置24 h、－20℃冻存1个月和－20℃反复冻融3次，按2.1.2项下方法处理后进行测定，以考察室温、冷冻、冻融3种条件下样品的稳定性。

2.2 生物等效性试验

2.2.1 给药 采用双处理、两周期随机交叉实验设计，将试验动物随机分成两组，每组12头。第一组第一周期给予受试制剂阿莫西林混悬注射液，第二周期给予参比制剂阿莫西林混悬注射液；第二组第一周期给予参比制剂阿莫西林混悬注射液，第二周期给予受试制剂阿莫西林混悬注射液。动物给药前称量体重并记录。根据阿莫西林混悬注射液的用法与用量要求，确定给药剂量为15 mg／kg体重，给药方式为颈部肌肉注射。两周期间隔10 d。

2.2.2 血样采集 分别在猪给药后10、20、30、45 min和1、2、3、4、6、8、10、12、24、30、36 h前腔静脉采血5 mL，加入含有抗凝剂的肝素钠玻璃管中，4000 r／min离心10 min，取上层血浆，－20℃保存。

2.2.3 血浆样品的处理 吸取血浆400 μL，按2.1.2项下方法处理后进行测定。

3 结果

3.1 血浆中阿莫西林测定方法的建立

3.1.1 标准曲线范围 本方法建立的标注曲线在0.2～20 μg／mL浓度范围内线性回归关系良好，典型标准曲线回归方程为：Y＝35300X＋3230，r＝0.999953。

3.1.2 检测限和定量限 根据5个空白样品的基线噪音值求其平均值，求得血浆中阿莫西林的LOD和LOQ分别为0.06和0.2 μg／mL。

3.1.3 专属性考察 在所建立的色谱条件下，分别得到空白血浆样品的图谱、空白血浆加入对照品溶液后的图谱以及给药后 3 h血浆样品的图谱（图1）。由图1可知，空白血浆中内源性物质不干扰阿莫西林的测定，保留时间为3.28 min。

图1 猪血浆样品中阿莫西林测定的HPLC典型色谱图

3.1.4 精密度和回收率 结果表明，所建立的方法回收率稳定，方法的精密度良好。符合《兽用化学药品生物等效性研究规范》的要求（表1）。

表1 精密度和回收率试验结果 （n＝6）

3.1.5 稳定性考察 低、中、高3个质量浓度的血浆样品，在不同条件下的稳定性结果测定偏差均小于15%，阿莫西林血浆样品稳定性良好。

3.2 血药浓度－时间曲线与药代动力学 24头猪以15 mg／kg体重肌肉注射受试制剂和参比制剂，取受试猪给药前及给药后15个时间点的血浆样品，按2.1.2项下方法处理后进行测定，用标准曲线计算阿莫西林血药浓度，采用WinNonlin6.4软件处理血药浓度并进行计算，得到受试制剂和参比制剂的平均血药浓度－时间曲线（图2）和动力学参数（表2）。

图2 猪肌肉注射15 mg／kg阿莫西林混悬注射液血药浓度－时间曲线

表2 猪肌肉注射受试制剂和参比制剂后的主要动力学参数

3.3 生物等效性评价 将AUC0－t、AUC0－∞、Cmax进行对数转化后进行方差分析，然后进行双单侧t检验及置信区间法计算，受试制剂AUC0－t、AUC0－∞的90%可信区间为 103.5%～144.5%、84.9%～131.6%，均超出了参比制剂AUC0－t、AUC0－∞的80～125%的范围；受试制剂Cmax的90%可信区间为124.7%～199.2%，也超出了参比制剂Cmax的70～143%的范围，说明两种制剂不等效；Tmax通过非参数检验，制剂间P值小于0.05，说明制剂间Tmax有显著性差异，Tmax不等效。

4 讨论

本研究中部分试验动物给药后出现了双峰现象，可能是混悬液中部分溶解的药物先在体内达到药峰，缓释部分为药物悬浮颗粒出现了二次释放。因此，在药动学参数计算和生物等效性计算采用了非房室模型［3］。健康猪肌肉注受试制剂后，达峰时间3.45 h，峰浓度6.94 μg／mL，消除半衰期6.49 h，参比制剂的达峰时间1.34 h，峰浓度4.39 μg／mL，消除半衰期14.21 h。与参比制剂相比，受试制剂的达峰时间晚，峰浓度高，消除较快。但在同等剂量下，受试制剂在受试个体体内的暴露量较参比制剂高，AUC、Cmax均高于参比制剂，说明两制剂不等效。药代动力学参数试验结果与肖希龙［2］、曾振灵［4］报道结果有差异，其原因可能与受试动物的个体差异、制剂的生产工艺、溶剂、辅料等因素有关。

阿莫西林属时间依赖性抗菌药，当浓度在最低抑菌浓度（MIC）以上时发挥抗菌作用［5］。根据文献资料，该血浆浓度在猪体内能对金黄葡萄球菌［6］、胸膜肺炎放线杆菌［7］、副猪嗜血杆菌［7］、多杀性巴氏杆菌［5］的生长能起到有效地抑制作用。试验结果表明，受试制剂在给药24 h后，猪血浆中的阿莫西林基本都不能检出，参比制剂给药36 h后，猪血浆中尚能检出阿莫西林，说明受试制剂在猪体内的药效维持时间较短，一天后已经无药效作用，不能达到产品规定的两天一次给药的要求，表明受试制剂尚需进一步研究。

［1］何 斌，陆 征，陈 杰，等.阿莫西林在肉鸡体内的药物动力学研究［J］.湖北农业科学，2014，53（23）：5813－5815.

［2］肖希龙，胡英杰，高翠华，等.阿莫西林注射用混悬液及其在猪体内的药物动力学研究［J］.畜牧兽医学报，2003，34（3）：299－303.

［3］黄耀凌，徐 倩，胡海燕，等.盐酸多西环素注射液在猪体内药代动力学－药效学研究［J］.中国兽药杂志，2014，48（6）：52－57.

［4］曾振灵，何小娟，黄显会，等.阿莫西林注射混悬剂的研制及其在猪体内的药动学［C］.中国畜牧兽医学会兽医药理毒理学分会第九次学术讨论会，合肥.2006.

［5］张玲玲，江善祥.阿莫西林药理与毒理研究进展［J］.兽药与饲料添加剂，2009，14（1）：20－22.

［6］杨雨辉，李笑春，韩新畴，等.阿莫西林在猪血清和组织液中对金黄色葡萄球菌的半体内药动－药效同步模型的研究［J］.中国农业科学，2010，43（8）：1723－1729.

［7］曹传家，王春梅.阿莫西林对副猪嗜血杆菌和猪胸膜肺炎放线杆菌的药敏试验［J］.湖北畜牧兽医，2014，35（6）：9－10.

（编 辑：陈 希）

Bioequivalence of Amoxicillin Suspension Injection in Pigs

PAN Juan，YAN Feng，GU Xin
（Shanghai Institute for Veterinary Drug＆Feeds control，Shanghai201103，China）

To evaluate the pharmacokinetics and bioequivalence of amoxicillin suspension injection in pigs.In a randomized two－way self－crossover study，24 healthy pigs were randomly divided into two groups，and were given respectively a single dose of test or reference preparations by intramuscular injection（15 mg／kg）.Plasma concentrations of amoxicillin were measured by HPLC.The pharmacokinetic parameters were calculated by WinNonlin6.4 software，and the bioequivalence were evaluated.The main pharmacokinetic parameters of the test and reference preparations were as follows：Tmaxwere（3.45±2.49） h， （1.34±1.74） h；Cmaxwere（6.94±4.73）mg／L，（4.39±2.87）mg／L；AUC0－twere（37.00±11.48）mg·h·L－1，（30.02±8.93）mg·h·L－1；AUC0－∞were（40.26±13.36）mg·h·L－1，（38.46±15.38）mg·h·L－1.The pharmacokinetic parameters（AUC0－t、AUC0－∞，Cmax、Tmax）showed significant difference between test and reference preparations of amoxicillin suspension injections.The test and reference formulations are not bioequivalent after two one－side t－test.This study will provide theoretical basis for making of veterinary clinical dosage regimen and clinical rational administration.

amoxicillin suspension injection；HPLC；pharmacokinetics；bioequivalence

2015－03－09

A

1002－1280（2015）04－0056－04

S859.79

潘 娟，硕士，畜牧师，从事兽药饲料检测工作。E－mail：ipanjuan＠163.com