甘草黄酮对氧化损伤小鼠体内抗氧化作用的影响

刘俊峰 刘永宏 郭雪峰

(塔里木大学动物科学学院/新疆生产建设兵团塔里木畜牧科技重点实验室， 新疆 阿拉尔 843300)



甘草黄酮对氧化损伤小鼠体内抗氧化作用的影响

刘俊峰 刘永宏 郭雪峰*

(塔里木大学动物科学学院/新疆生产建设兵团塔里木畜牧科技重点实验室， 新疆 阿拉尔 843300)

研究甘草黄酮对酒精氧化损伤小鼠体内MDA的含量及T-SOD的活力的影响；采用每天定时定量给小鼠灌胃不同浓度的甘草黄酮来研究甘草黄酮对氧化损伤小鼠体内MDA、T-SOD活力的影响。采用健康且体重相近的60只小白鼠，平均体重18±2 g，随机分为6组，每组10只。实验全期自由饮水，在第42d，分别取血清、肝脏和脑组织。实验测定对照组和实验组的小白鼠血清中的MDA的含量和T-SOD的活性。结果表明：实验组的T-SOD的活性显著高于对照组(P<0.05)，实验组的MDA的质量分数与对照组相比差异显著(P<0.05)。

甘草黄酮； 丙二醛； 总超氧化歧化酶

甘草多生长在干旱、半干旱的荒漠草原、沙漠边缘和黄土丘陵地带。研究表明，甘草抑制引起糖尿病的醛糖还原酶和单胺氧化酶，镇痛解痉、防治治疗老年性骨质疏松症和病毒性肝炎、抗利什曼原虫、抗艾滋病(AIDS)、抗癌等作用[1]。甘草提取物一般包含：甘草甜素、甘草酸，甘草苷、甘草类黄酮、后幕比檀素、刺芒柄花素、槲皮素等。为黄色至棕黄色粉末[2-3]。在新疆主要有乌拉尔甘草(G.uralensis Fisch)、胀果甘草(G.inflate Bat)和光果甘草(G.glabraL)。中国是世界上研究甘草最早的国家[4]，甘草中主要含有甘草酸、甘草次酸、黄酮、生物碱和氨基酸等成分[5]。近年来我国学者进行了大量甘草提取物的化学成分的研究[6]。研究结果显示，甘草黄酮具有起泡性和溶血作用很低、安全无毒和较强的医疗保健功效，显著抑制脂质体过氧化物的作用也广泛被应用[7]。近年来研究发现，广泛使用的人工合成抗氧化剂对人体具有多种损害作用，使得天然抗氧化剂越来越多受到食品工作者的重视。甘草抗氧化剂就是其中之一。发现极性亚油酸甲酯中，甘草溶剂萃取物具有很好的抗氧化效果[11]。关于天然抗氧化剂的研究在国内也有诸多的报道，在食品上主要应用甘草黄酮成分作为天然抗氧化剂，但是，在动物饲料添加剂上的研究较少，尤其甘草黄酮对酒精氧化损伤小鼠血清的抗氧化调控及作用报道较少。另外研究证明甘草黄酮能够清除自由基能力较强,对脑组织脂质过氧化具有拮抗作用[12]。Fenton反应生成的羟自由基，甘草总黄酮具明显的直接清除作用,对于羟自由基的IC50清除能力是甘露醇的1/255,抑制羟自由基生成的IC50是甘露醇的1/139[13]。研究显示，甘草黄酮类化合物对4种活性氧具有清除效应[14],甘草黄酮可降低β-胡萝卜素损耗,国外学者从抗低密度脂蛋白(LDL)氧化的角度阐明抗过敏、抗血栓、抗肿瘤、抗炎等作用之间的关系[15]。本研究主要了解甘草黄酮对小白鼠血液和组织中的丙二醛、超氧化物歧化酶抗氧化性能的影响，探索甘草黄酮作为伴侣动物日粮添加剂的应用前景提供必要的理论支持。

1 材料与方法

1.1 实验动物分组

实验小白鼠购买于新疆医科大学实验动物中心(清洁级)，平均体重18±2 g，随机分为6组，每组10只。空白对照组：正常饲喂；模型组：每天给予同等体积的生理盐水并每只每天颈背部皮下注射D-半乳糖400 mg/kg·bw；其余各组小鼠每只每天颈背部皮下注射D-半乳糖400 mg/kg·bw；同时，每天灌喂，维生素C组：100 mg/kg·d；甘草黄酮高剂量组：150 mg/kg·d；甘草黄酮中剂量组：100 mg/kg·d；甘草黄酮低剂量组：40 mg/kg·d；每组10只重复，实验期42 d。

1.2 实验动物的剂量与饲养管理

甘草黄酮在基础日粮除外还要灌服的剂量为：低剂量组40 mg/kg·d，中剂量组100 mg/kg·d，高剂量组150 mg/kg·d。每天一次灌胃，定时定点。每天饲喂时观察记录每组小鼠的精神状况、死亡及小鼠更换情况等一系列变化。实验第42 d时，取材包括采血和取样。取材：全脑、肝脏、→生理盐水冲洗2次→滤纸吸干→称重→浸入甲醛液中。采血：每只断头采血1～1.5mL，装入抗凝采血管(禁止摇晃)。3 500 r/min离心10 min取血清，-20 ℃低温保存。于南京建成科技有限公司购置实验试剂盒。应用T6-新世纪分光光度计测定所有吸光度指标。

1.3 组织样本的前处理

将各组织块剪碎倒入玻璃匀浆管中，再将剩下的1/3匀浆介质冲洗残余在小烧杯中的碎组织，然后一起倒入玻璃匀浆管中进行匀浆，将匀浆管下端插入盛有冰水的器皿中，转动研磨数十次，充分磨碎组织块。

1.4 小白鼠血浆与组织中MDA 和T-SOD测定

1.4.1 仪器设备

550 nm分光光度计、37 ℃恒温水浴箱、旋涡混匀器、台式离心机、可调式移液器、量筒150 mL 1个、烧杯100 mL 、20 mL各1个、烧杯50 mL 6个、烧杯10 mL 3个、试管 40个、离心管 9个。

1.4.2 测定方法

根据试剂盒说明书操作方法进行，血清取20 μL；肝组织取1%组织匀浆10 μL、脑组织取1%组织匀浆30 μL。混合均匀,室温下放置10分钟，设定分光度计波长为550 nm处，选用1 cm光径比色杯，用蒸馏水调零。

1.5 数据处理

采用Excel和SPSS13.0软件中的平衡实验设计方差分析过程(ANOVA)，多重比较采用Duncan法进行。应用t检验分析两组间均值差异，测定值用平均值±标准差(x±s)表示。

2 结果与分析

2.1 最佳取样量的确定

表1 最佳取样量结果

最佳取样量=(对照管吸光度-测定管吸光度)/ 对照管吸光度×100%；最佳取样量取百分抑制率在48%～55%之间。最佳取样浓度用黑体字表示。本实验血浆的最佳取样量为20 μL；测定得出肝组织匀浆最佳取样量为10 μL；脑组织匀浆的最佳取样量为30 μL。另外测定的结果表明：血浆、肝组织、脑组织的百分抑制率分别为53. 14%、 48. 97%、 53. 12%。

2.2 甘草黄酮对小鼠体内T-SOD活力的影响

表2 小鼠体内T-SOD活力的测定结果(±S)( n=10)(U·ml-1)

注：*表示与对照组和模型组比较差异显著P<0. 05；△表示甘草黄酮模型、低、中、高剂量组间比较差异显著P<0. 05。

根据表2分析得出：血浆组、肝组织组、脑组织组中实验对照组、Vc组和空白对照组相比，实验对照组活力有所下降，Vc组变化不明显。原因是D-半乳糖作用使小鼠体内产生氧化损伤，抗氧化性降低，表现出SOD的活力降低。实验组和对照组、模型组结果相比较，SOD活力均有上升趋势，剂量组和空白对照组、实验对照组之间差异显著(P<0. 05)。说明甘草黄酮能提高小白鼠机体内SOD活力。

SOD是生物体内清除自由基的首要物质，现已证实多达60多种疾病是由氧自由基引发的。另外SOD能够对抗与阻断氧自由基对细胞损害，并及时修复受损细胞，同时SOD作为机体内天然存在的超氧自由基清除因子可以把有害的超氧自由基转化为过氧化氢。在血浆组、肝组织组、脑组织组的实验组与模型组比较差异显著(P<0. 05)。实验组超氧化物歧化酶活力升高。甘草黄酮的低、中、高剂量组间比较，三个高剂量组的SOD活力均有上升趋势。说明甘草黄酮的浓度越高对小白鼠超氧化物歧化酶活力的提高作用越大。肝组织、脑组织(P<0. 05)，三者差异显著。且肝组织组的高剂量组的SOD活力上升趋势最大，其次是脑组织。表明甘草黄酮能够提高氧化损伤的小鼠体内SOD的活力。

2.2 甘草黄酮对小鼠体内MDA含量的影响

表3 小鼠体内MDA含量的测定结果(±S)( n=10) (U·ml-1)

注：*表示与对照组、模型比较差异显著，P<0. 05；**表示与对照组比较差异极显著P<0. 01；△表示实验对照组、低、中、高剂量组间比较P<0. 05，差异显著。

根据表3分析得出：血浆组、肝组织组、脑组织组中模型组、Vc组和对照组相比，模型组表现出上升趋势，Vc组变化不明显。小鼠机体中MDA的含量高低，可直接反映小鼠机体内脂质过氧化水平，进一步说明组织细胞损伤的程度。氧化损伤使小鼠体内抗氧化性降低，从而机体脂质过氧化程度升高，则MDA的含量升高。也证明氧化损伤模型建立成功。实验组与对照组、模型组结果相比较，实验组的MDA活力含量均有下降，并且血浆组和肝组织组两者差异极显著(P<0. 01)，脑组织组差异显著(P<0. 05)。说明甘草黄酮对小白鼠血浆中MDA具有抑制作用。本研究血浆组、肝组织组、脑组织组的甘草黄酮的模型组与实验组中低、中、高剂量组间比较(P<0. 05)，表明实验对照组与剂量组差异显著。低、中、高三组实验组的MDA含量与对照组相比较均有所下降，且差异显著(P<0. 05)，切高剂量组MDA含量下降更明显，说明甘草黄酮的浓度越高，对小白鼠血浆中的MDA的含量的抑制作用越明显，但脑组织的高剂量组表现出的却是MDA的含量较中剂量组有所上升。说明甘草黄酮会抑制氧化损伤的小鼠体内的MDA含量，此作用对肝组织较明显，其次是脑组织。

3 讨论

本实验通过对生长良好、健康的小鼠饲喂甘草黄酮后的血浆、肝组织、脑组织抗氧化指标的测定，结果表明：

3.1 剂量组较空白对照组、实验对照组、Vc组的氧化损伤的小鼠体内的MDA含量有降低趋势且趋势明显，表明甘草黄酮对机体中MDA有抑制作用，抑制作用极显著(P<0. 01)。低、中、高剂量组差异明显(P<0. 05)，低、中、高剂量组中MDA含量下降幅度呈现逐渐增加趋势，高剂量组下降幅度明显大于低、中剂量组。但对脑组织，甘草黄酮的剂量不宜过大，确定在以固定值即可，因为剂量越大，反而会削弱甘草黄酮对MDA含量的抑制作用。

3.2 实验组较空白对照组、实验对照组、Vc组的氧化损伤的小鼠体内的T-SOD的活力有明显的上升趋势(P<0. 05)，表明甘草黄酮对机体中T-SOD活力具有提高作用。低、中、高剂量组中T-SOD的活力呈现逐渐上升趋势，且高剂量组的上升幅度明显大于低、中剂量组，表明甘草黄酮的浓度越高对T-SOD的活力提高作用越大。

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Effects of Licorice Flavonoids on the Oxidative Damage Antioxidant Index of Body in Mice

Liu Junfeng Liu Yonghong Guo Xuefeng*

(College of Animnl Science,Tarim University/Key Laboratory of Tarim Husbandry Science and Technology, Xinjiang Production & Construction Group, Alar, Xinjiang 843300)

The study was the effects of licorice flavonoids on the MDA concentration and T - SOD vitality of rats by alcohol oxidation damage. The effects of licorice flavonoids on the MDA concentration and T - SOD vitality of rats by oxidation damage were studied by using rats that were intragastric dministration with different concentrations of licorice flavonoids on timing per day. The healthy 60 rats with similar weight that is 18 ±2 g averagely were randomly divided into 6 groups, each group were 10 rats. The rats were free drinking water during experimental period, and the serum, liver and brain tissue of the rats were collected respectively in 42d. The MDA concentration and T - SOD vitality of the serum were determined in both of the control group and experimental group. The results show that T - SOD vitality of the experimental group was significantly higher than the control group (P < 0.05), the mass fraction of MDA of the experimental group was significant difference compared with control group (P < 0.05).

Licorice flavonoids; MDA; Total superoxide dismutase

2014-9-6

塔里木大学校长基金(TDZKSS201305)

刘俊峰(1980-)，男，讲师，硕士，主要研究方向为植物提取物与饲料添加剂。 E-mail：liujunfeng423@163.com

E-mail：gxfdky@126.com

1009-0568(2015)02-0018-05

S

ADOI：10.3969/j.issn.1009-0568.2015.02.004