氨基肽酶N在肾细胞癌组织的表达及意义

陈平锋

（南华大学附属第一医院 泌尿外科，湖南 衡阳421001）

肾细胞癌是起源于肾小管上皮细胞的一类恶性肿瘤，占成人恶性肿瘤的2%～3%，在成人泌尿生殖系统肿瘤中发病率仅次于膀胱癌，居第2位[1]，且发病和死亡率有逐年增高的趋势。患者初诊时约45%已有肿瘤转移，50%～60%的肾癌患者术后有肿瘤复发。肾癌具有特殊的遗传生物学特性和异质性，较易发生转移，传统的放化疗对晚期转移性肾癌极不敏感。多年来应用分子免疫、基因治疗以及抗肿瘤血管形成的分子靶向治疗对晚期或转移性肾癌己取得令人满意的疗效。在对肾癌的诊断、治疗和预后相关性研究中，大量的肿瘤相关因子表现出良好的应用前景。

氨基肽酶N（aminopeptidase N，APN） 又名CD13是一种Ⅱ型膜结合锌离子金属蛋白酶，可以将氨基酸从寡肽N末端切除的膜结合糖蛋白[2]。CD13最早主要作为髓细胞表面标志物用于白血病分类的鉴别。近年来CD13在肿瘤方面的相关研究日益增多。研究表明其在体内通过单一机制或多个机制协同作用参与肿瘤病理生理过程。CD13通过蛋白水解酶的作用，降解细胞外基质，参与肿瘤间的信号传导，参与新生血管形成，导致肿瘤的浸润和转移[3]。本研究采用免疫组化方法研究了肾癌组织中CD13的表达情况，并分析其与临床病理学因素的关系，以期为肾癌的诊断、预后及靶向治疗提供依据。

1 材料与方法

1.1 一般资料

收集2006年6月-2009年6月南华大学第一附属医院手术切除的肾癌、癌旁、远癌新鲜组织各93例，所有标本术前均未经放、化疗，并经术后病理学确认均为肾细胞癌。从每例患者的手术标本中分别取癌组织、癌旁组织和远癌组织，癌组织均在原发灶取材，避开坏死、炎症区域；癌旁组织取自相应肿块旁0.5～2 cm的肾组织;远癌组织均取自距肿块边缘5 cm以上的肾组织。标本均在术中离体后立即收集，取材均为黄豆粒大小，取材后立即冻存保存于液氮中。93例标本中，其中，男62例，女31例；年龄<60岁56例，≥60岁37例；透明细胞癌64例，乳头状细胞癌13例，嫌色细胞癌12例，集合管癌4例；临床分期：Tl期32例，T2期34例，T3～T4期27例；病理组织学分级：Gl级24例，G2级37例，G3～G4 26例；有淋巴结转移27例，无淋巴结转移66例。

1.2 试剂

CD13单克隆抗体（美国Santa Cruz公司），兔抗人VEGF多克隆抗体（货号ZA-0509，北京中杉公司），PV-9000试剂盒（北京中杉公司），DAB显色试剂盒（北京中杉公司）。

1.3 免疫组织化学PV-9000法

将存档的石蜡标本重新制备4μm厚切片，脱蜡，再水化。置于pH 6.0的柠檬酸缓冲液中行高压抗原修复后，3%双氧水（H2O2）消除切片内源性过氧化物酶活性。滴加一抗（CD13单克隆抗体，工作液浓度为1∶150；兔抗人VEGF多克隆抗体，即用型，稀释度1∶100），4℃冰箱湿盒内孵育过夜。滴加二抗试剂1和试剂2（PV-9000试剂盒），并置于37℃恒温箱内孵育30min。显微镜下DAB显色，苏木素复染，盐酸乙醇分化，脱水至透明，中性树胶封片。用已知肝癌阳性切片作为阳性对照，磷酸盐缓冲液（PBS）代替一抗作为阴性对照。结果判定：由2位不知晓患者临床资料的病理医师进行结果判定。以胞核内有黄或棕黄色颗粒染色者为CD13阳性细胞，阳性细胞所占百分比<10%计为Spl阴性，10%～50%者计为CD13阳性表达，>50%者为强阳性。

1.4 统计学方法

应用SPSS 18.0统计软件进行分析，各组间比较采用χ2检验或Fisher's精确概率法，相关分析采用Spearman等级相关分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CD13与肾细胞癌临床病理参数的相关性

CD13主要表达于癌细胞膜，CD13阳性表达（+）和CD13强阳性表达（++）（图1）。CD13在93例肾癌组织中阳性表达率为73.11%（68/93），癌旁组织中阳性表达率为21.51%（20/93），正常肾组织中阳性表达率为6.45%（6/93）。三者表达差异具有统计学意义（P<0.05，表1）。肾细胞癌中CD13蛋白表达与肿瘤大小、年龄、性别无相关性，而与淋巴结转移、肿瘤分级及TNM分期有关（P<0.05，表2）。

2.2 CD13在肾细胞癌中的表达与预后的关系

肾细胞癌组织中CD13表达阳性患者1、3及5年生存率分别为50.0%（34/68）、20.43%（15/68）及2.94%（2/68）；CD13阴性表达患者1、3及5年生存率分别为88.0%（22/25）、76.0%（19/25） 及32.0%（8/25）。CD13表达阳性患者1、3及5年生存率均低于CD13表达阴性者，差异有统计学意义（P<0.05）。K-M生存曲线分析（图2）显示CD13阳性表达组（+）中位生存时间为13.86个月，CD13强阳性表达组（++）中位生存时间为8.76个月，CD13阴性表达组中位生存时间为51.50个月。CD13阳性表达组患者预后明显差于CD13阴性表达组，其中CD13强阳性表达组（++）病例预后最差。Log-rank检验显示差异有统计学意义（P<0.05）。多因素COX逐步回归分析提示肾癌患者的预后与CD13表达、TNM分期相关，CD13是影响总体生存率预后的独立危险因素，差异有统计学意义（P<0.05）。

图1 CD13在肾细胞癌中的表达

表1 CD13蛋白在肾癌、癌旁、正常组织的表达 （n=93）

表2 肾癌组织中CD13蛋白表达与临床特征之间的关系 [例（%）]

图2 CD13表达阳性、强阳性和阴性肾癌患者的生存曲线

3 讨论

目前研究证实，CD13参与多种人类肿瘤的发生发展过程，其可能的机制包括四个方面。①CD13能够通过降解细胞外基质，释放促进肿瘤细胞增殖的生长因子，也可间接调节肿瘤细胞增殖信号，或作为一种特殊受体参与MMP（matrix metalloproteinase）的过表达过程，最终导致肿瘤细胞的增殖生长[4-5]。②CD13还参与肿瘤新生血管的形成，新生血管形成主要与Ras-丝裂原活化的蛋白激酶（MAPK）途径和Ras-PI K途径2条途径有关，而CD13是Ras介导的两个信号传导途径的靶分子。活化的Ras、Raf、MAPK传递信号到核内，使核转录因子Ets-2磷酸化。活化的Ets-2与CD13近端启动子相结合，启动转录[6]。③CD13还参与肿瘤细胞的局部侵袭和远处转移，CD13可水解靶器官或靶组织的细胞外基质、基底膜（基膜和Ⅳ型胶原蛋白），从而使原发灶的肿瘤细胞随血液或淋巴液循环迁移黏附形成转移灶；④CD13可通过降解IL-8、MHCⅡ型黏附抗原决定簇而降低T细胞对肿瘤细胞的识别，从而降低机体免疫功能，导致肿瘤细胞存活[7]。

近年的研究显示CD13在肺癌、胃癌、乳腺癌、结肠癌、卵巢癌、胰腺癌等多种恶性肿瘤细胞表面均有异常表达而且与某些肿瘤的分化状态、临床分期和预后相关[8-10]。但是对于CD13在膀胱癌中的表达及其与预后的关系，相关研究不多。本研究显示膀胱癌组织CD13的阳性表达率高于癌旁组织以及正常膀胱组织，而且淋巴结转移及肿瘤分级分期相关。目前临床上最为常用的膀胱癌诊断方法为尿细胞学（UC）检查，但近年发现UC检查对早期患者的敏感性不甚令人满意，临床亟需更加敏感或特异的生化标志物。VAN等[11]对全血、良恶性胸腹水及肿瘤内液可溶性CD13（sCD13）水平进行研究表明：恶性肿瘤患者血浆或胸腹水中的sCD13的水平明显高于良性疾病患者。乳腺癌、卵巢癌和骨肉瘤患者体液中sCD13显著升高，提示sCD13水平有助于恶性肿瘤的诊断。IKEDA等[12]对50例胰腺癌患者研究显示，CD13与肿瘤新生血管有关，可作为胰腺癌的独立的诊断标志。因此，根据以往和本研究结果，笔者大胆推测CD13有可能作为一个新的膀胱癌诊断标志物，但具体方法有待进一步研究。CD13与淋巴结转移、肿瘤分级及临床分期有关，提示CD13与膀胱癌的浸润、转移关系密切，参与了肿瘤的发生发展过程。CD13阳性表达组病例的1、3及5年生存率显著低于CD13阴性表达组，CD13阳性表达组患者预后较差。

COX分析显示CD13是影响膀胱癌患者预后的危险因素。这些结果提示CD13的表达也可以作为判断预后的一项指标。

研究表明CD13抑制剂可通过半胱天冬酶-3信号途径和磷脂酰肌醇-3激酶（P13K）-糖原合酶（GSK）信号途径诱导K562细胞和急性白血病细胞U937凋亡[13]。其代表药物为Bestatin，是一种从橄榄网状链霉菌培养液发现的小分子肽。目前，CD13抑制剂已用于动物肿瘤转移模型的治疗，已有多种药物在人类临床前实验中取得良好的抗肿瘤效果。TSUKAMOTO等[14]研究表明Bestatin能提高宫颈癌化疗疗效，诱导宫颈癌细胞Hela凋亡。CHRIST等[15]研究发现Bestatin能诱导膀胱癌细胞凋亡，提高膀胱癌化疗疗效。NGR血管跟踪肽即天冬氨酸-甘氨酸-精氨酸（Asn-Gly-Arg）是CD13的特异性受体。以NGR为载体，将各种抑癌物质如阿霉素、肿瘤坏死因子和抑癌基因特异结合研究肿瘤血管靶向治疗新药物，可增加疗效，减少全身用药，降低不良反应。CHEN等[16]将包裹阿霉素的脂质体和抑癌基因与NGR结合靶向导入CD13阳性表达的人纤维肉瘤细胞Ht-1080，引起CD13表达阳性的Ht-1080细胞凋亡。然而CD13在人体分布范围广、功能多并参与各种生理病理过程，因此，只有研制出选择性高、组织特异性好的CD13靶点药物才可有效抗肿瘤，否则会影响机体功能，产生多种并发症。综上所述，检测CD13对膀胱肝癌的诊断、预后及治疗具有一定的临床应用价值。

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