济源奶牛新孢子虫病血清流行病学调查与分析

李小军

(河南省济源市动物卫生监督所，河南 济源 459000)

新孢子虫可感染多种动物，其危害最为严重的中间宿主是牛。目前检测牛新孢子虫抗体的血清学方法主要包括ELISA、IFAT、凝集试验以及Westernblot试验等。ELISA具有较高的特异性、稳定性，操作方法简便，易于掌握，可用于大规模的流行病学调查。因此，本实验采用间接ELISA，对采集的奶牛血清进行新孢子虫阳性检测。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器设备

1.1.1 主要试剂：备检血清（济源采集分离如表1-1所示，河科大保存），新孢子虫间接ELISA试剂盒（其主要成分如表1-2所示）

1.1.2 仪器设备：冰箱，台式高速离心机，恒温培养箱，酶标检测仪，微量移液器等。

表1-1 备检血清样本数及来源

1.2 血样采集和血清分离

1.2.1 血样采集：在流产率较高的6个奶牛场（区）中，采集有流产史的母牛血样。用牛尾静脉采血，每头5 mL左右。做好样品的编号和详细记录母牛信息。

1.2.2 血清的分离与保存：血液样品平放37℃恒温箱2h，放入4℃冰箱过夜，离心机2000～3000r/min离心5～10min，离心管上层清液即为血清。用移液器收集于干燥的离心管中，贴上标签保存于-20℃冰箱中备用。

表1-2 新孢子虫间接ELISA试剂盒

2 血清ELISA 检测

2.1 试剂盒保存

ELISA试剂盒开封前避光存放于4℃冰箱中，包被板密封防潮。从冰箱取出后在室温条件下放置一段时间，方可使用。

2.2 血清检测

2.2.1 溶液的配制：试剂盒中所用稀释液为含1%BSA的PBS，洗涤液为含0.05%PBST的蒸馏水或去离子水，充分混匀即可，每次试验现用现配。

2.2.2 将待检血清用含1%BSA的PBS按1:100的比例进行稀释，每孔100μL，37℃孵育1个小时。

2.2.3 编号：将样品对应微孔按序编号，每板应设阴性对照2孔、阳性对照2孔、空白对照2孔。

2.2.4 洗涤：甩去酶标反应板内液体，然后用配好的0.05%PBST洗涤液，每孔加300μL，室温静置3min，在吸水纸上拍干，反复洗涤三遍。

2.2.5 将二抗按1:22000的比例进行稀释，每孔加100μL，37℃孵育1h。

2.2.6 洗涤同步骤2。

2.2.7 显色：将A液和B液1:1现配制（避光），每孔加100 μL，37℃避光放置15 min。

2.2.8 终止反应：每孔加终止液50μL，终止液为2mol/L硫酸。

2.2.9 终止液加完后，应立即在酶标仪上于OD450、OD630检测。

2.3 结果判定

2.3.1 Cut-off值（COV）=阴性对照平均OD值×2.1（阴性对照孔OD值＜0.08时按0.08计）。

2.3.2 有效判定：空白对照孔OD值＜0.05（若大于0.05则实验无效），阴性对照孔OD值≤0.10（若大于0.10则实验无效），阳性对照孔OD值≥1.0（若小于1.0则实验无效）。

2.3.3 样本OD值≥COV值时，判为新孢子虫抗体阳性；

3 结果

3.1 济源市奶牛新孢子虫感染情况

表1-3 济源市新孢子虫抗体检测结果

由表1-3可知，198份血清样本中，新孢子虫抗体阳性率高达44.44%。

3.2 血清样本检测结果

表1-4 血清样本检测结果

4 结果分类比对

4.1 不同饲养环境与阳性率之间的关系

表1-5 饲养环境与新孢子虫抗体阳性率的关系

由表1-5可知，在不同饲养环境中，奶牛新孢子虫抗体阳性率存在差异性，经卡方检验计算x2=0.58，P＞0.05，差异不显著。

4.2 流产奶牛与正常奶牛之间新孢子虫阳性率之间的关系

表1-6 流产奶牛与正常奶牛之间新孢子虫抗体阳性率之间的关系

由表1-6可知，在流产奶牛与正常奶牛中，新孢子虫抗体阳性率存在差异性，经卡方检验计算x2=4.15，0.01

4.3 不同年龄段与新孢子虫抗体阳性率之间的关系

表1-7 不同年龄段与奶牛新孢子虫抗体阳性率之间的关系

由表1-7可知，不同年龄段新孢子虫抗体阳性率存在差异性，经卡方检验计算x2=2.77，P>0.05，差异不显著。

5 讨论

5.1 济源奶牛新孢子虫感染率与其它地方比较

本试验对济源奶牛进行新孢子虫流行病学调查，阳性率为44.44%。马利青调查，阳性率为4.35%；张昌盛等报道的北京地区阳性率18.1%(17/94)；于晋海等调查，阳性率为17.2%；邹世颖等调查，阳性率平均为8.6%；济源奶牛新孢子虫感染率要远高于其它地区。