一种关于发酵车间菌种室及霉菌室的布局思路

吴少华 窦竹杰 潘厚昌

（中核第四研究设计工程有限公司，河北石家庄 050021）

一种关于发酵车间菌种室及霉菌室的布局思路

吴少华 窦竹杰 潘厚昌

（中核第四研究设计工程有限公司，河北石家庄 050021）

依据GMP（2010年版）规范要求，结合菌种培养和取样菌检的特点，提供了一种关于发酵车间菌种室及霉菌室的平面布局思路。

菌种制备；菌种保藏；霉菌化验；洁净环境

抗生素的发酵是一个纯种培养过程。因此，在菌种制备与保存过程中，防止其他杂菌的污染是生产中的一个重要环节[1]。

菌种制备是抗生素发酵生产的第一道工序，包括两个过程，即生产大量孢子的孢子制备过程和生产大量菌丝的种子制备过程。孢子是在菌种室内利用固体培养基制备的，之后可转入摇瓶培养基中培育菌丝体。而生产用种子是在发酵车间的种子罐中制备的。本文在研究菌种制备过程的基础上，探讨了关于菌种室、霉菌室的布局方法和思路。

1 菌种制备的工艺过程及条件

虽然发酵生产有固体培养与液体发酵之分，或者有厌气与需氧之分，但生产工艺流程却基本相似。传统发酵产品的主要工艺流程概括如图1。

图1 发酵主工艺流程框图Fig.1 The block diagram of fermentable process

保存在砂土管或者冷冻管中的菌种，在接入种子罐之前，需要经过扩大繁殖才能获得接种所需要的菌种数。扩大繁殖的方法有两种：一种是在固体培养基上生长繁殖成大量的孢子，然后制成孢子悬浮液，直接接入种子罐；一种是将固体培养基上繁殖的孢子接入摇瓶液体培养基中，使其生长繁殖成菌丝，再转入种子罐内。前一种方法叫孢子进罐法，后一种方法叫摇瓶菌丝进罐法。

孢子进罐法是将固体培养基上繁殖的孢子制成悬浮液，直接进罐，此种方法适用于细菌、霉菌及一些放线菌（如四环素、土霉素产生菌等），该工艺过程简单，节省人力，又可减少杂菌污染的机会，缺点是砂土管或冷冻管的用量较大。

摇瓶菌丝进罐法是在摇瓶内装入一定数量的液体培养基，灭菌后用无菌操作方法接入孢子，放在摇床上于恒温下进行培养。培养结束后，通过微孔差压法或打开接种口在火焰保护下接种。摇瓶菌丝进罐法适用于生长发育缓慢的放线菌，如链霉素产生菌，该法可以节省砂土管或冷冻管的用量，缩短种子在种子罐内的生长时间，缺点是菌丝不易保存，并增加杂菌污染的机会。

表1 菌种制备工艺温度条件Tab.1 Temperature condition of producing bacteria preparation

孢子进行斜面培养时，南方宜将相对湿度控制在35 %～42 %，北方则宜控制在40 %～45 %，所得的孢子数量适中，较成熟，外观好。

2 菌种保藏的方法

菌种保藏是根据菌种的生理、生化特点，创造条件使菌种的代谢活动处于不活泼的状态。常用的菌种保藏方法见表2。

表2 菌种保藏方法[2]Tab.2 Preservation methods

除上述常用的菌种保藏方法外，近年来，超低温保藏法（用液氮-196 ℃冻结）、冻结保藏法（一般低温如-20～-70 ℃冻结）、蒸馏水保藏法等的应用越来越普遍。

3 菌种室及霉菌室功能区域划分及布局方法

菌种室及霉菌室的平面设计在满足GMP要求的基础上，尚需遵循以下几点原则：

（1）尽量远离灰尘、有害气体、噪声、振动源等干扰；

（2）应充分考虑有害菌种对实验环境及人员的污染，设置必要的设施、防护、疏散等来降低风险，如房间负压、采用生物安全柜、排风过滤等等；

（3）实验室内部应能灵活调整，以适应实验室发展变化的需求，如墙体、家具应能拆卸等；

（4）水、电、气及网络的容量应有一定扩容条件。

发酵车间菌种室的主要功能是制备培养基、接种和菌种培养。一般设置物品贮藏间、菌种冷藏间、准备间、消毒间、无菌室、摇瓶间等功能。霉菌室主要负责发酵车间中间样品的菌检及理化分析，对发酵液取样品的菌丝形态、菌浓、杂菌、发酵单位、糖氮含量等指标进行分析测定，一般设置准备间、理化实验室、储藏间、恒温室、接种室、生测室、仪器室、天平室、镜检室等。

种子制备基本工艺流程见图2，霉菌实验的基本工艺流程见图3。

图2 接种流程框图Fig.2 The block diagram of inoculation

图3 霉菌实验流程框图Fig.3 The block diagram of mould testing

培养基在一般环境下的准备间内配制完成后，经灭菌柜灭菌后传递至无菌室内。从菌种保存间内取出菌种，并通过气锁或传递窗传进无菌室。二者在无菌室内完成接种，之后移至摇瓶间培养，培养结束后投入种子罐内扩大培养。若种子罐接种量大，尚需在无菌室内将合格摇瓶合并至要求容积的容器内。

实验区内常用设备如表3。

表3 常用设备一览表Tab.3 The equipment list in used

（续表）

常规的菌种室、霉菌室的平面设计中，单走廊两面分功能间的较多。如图4，霉菌室与菌种室设置在同一个区域内，实验人员集中工作，便于车间空调布局，缺点是物流转运（如取样、菌种、培养基）距离加长，操作不便。

图4 某工程菌种室及霉菌室平面布局Fig.4 An layout of bacteria and mould room

本文提出的设计思路是以开放式实验室为主题，培养基准备间布置在中心或一端，配套房间设置在其周围。这种布局思路的优点是，可以在准备间设置种子组门禁系统以方便人员管理，同时降低微生物污染范围。此外，将菌种室和霉菌室分开布置，菌种室设置一级种子罐的操作平面上[3]，霉菌室设置在发酵罐的取样平面上，以方便分析化验。如图5～6。

另外，考虑到原料药市场需求波动性较大，为降低单一产品的市场风险，很多大型企业的产品近年来渐呈多元化态势，即多个不同品种的发酵车间同时生产。为便于集中管理多个发酵菌种，保证菌种质量，一些生产企业将菌种室集中设计成菌种中心，所有发酵菌种都在该楼制备和发放。该做法除汇集上述所有功能间外，通常还设有菌种选育、遗传育种、组织培养等功能房间。如图7。

4 关键房间洁净环境定义

药品生产质量管理规范（2010年修订）原料药附录内明确规定[4]：

（1）在无菌操作条件下添加细胞基质、培养基、缓冲液和气体，应当采用密闭或封闭系统。初始容器接种、转种或加料（培养基、缓冲液）使用敞口容器操作的，应当有控制措施避免污染。

（2）当微生物污染对原料药质量有影响时，敞口容器的操作应当在适当的控制环境下进行。

图5 某工程菌种室平面布局Fig.5 An layout of bacteria room

图6 某工程霉菌室平面布局Fig.6 An layout of mould room

菌种室内的无菌室为接种、合瓶的关键房间，通常设计为C级背景下的局部A级（用超净工作台实现局部A级）[5]，用以控制避免敞口时造成的污染。而摇瓶间内为封闭操作，需要降低环境影响波动，通常做成D级。准备间（包括试液及培养基配制/灭菌区域）、冰箱间、洗刷间等没有特殊要求的功能区域可设计为一般清洁环境。

霉菌室的接种室通常为一般区或D级环境加超净台设计，要求背景环境不低于取样环境。培养室用于放置细菌和真菌的培养箱或培养架，除有温度湿度要求外，可为一般环境。为避免假阳性也有设计为D级洁净区的案例，房间内放置培养架，整体作为恒温培养箱使用。其余化验房间如准备间、清洗间、烘干间等辅助房间可为一般清洁环境[6]。

图7 某工程菌种大楼平面布局Fig.7 An layout of bacteria building

5 几点补充

（1）菌种冷藏间、摇瓶间及种子组空调要求二级负荷配电，房间设置门禁系统，保证菌种安全。如处理有害性菌种，空调应采用不会暴露并接触有害物质的吸尘系统（如袋进袋出过滤器）。

（2）通常为保证无菌室环境安全，无菌室及摇瓶间洁净风直排。

（3）恒温室为恒温恒湿房间，温度可依据表1培养菌群要求确定，偏差控制在±1 ℃范围内，相对湿度控制在50 %～60 %。

（4）空调相关的控制面板可以集中于准备间内统一操作，以减少无关人员进入洁净区后的污染，便于在洁净区外控制各房间的运行状态。

（5）洁净区房间考虑臭氧定期消毒。

6 总结

在传统发酵的菌种培养和保存过程中，采取防止微生物污染的措施，对染菌事件控制非常重要。如果在操作过程中使用了敞口容器，应有严格的控制措施和规程以便将污染的风险降低到可控的最低限度范围[7]。本文提供了一种菌种室及霉菌室的设计思路，随着现代制药工业的发展，本文所提及的观点和方法仍需在实践中检验并加以修正和提高。

[1]邬行彦，等.抗生素生产工艺学[M].北京：化学工业出版社，1985.15-21.

[2]付美红，等.微生物菌种的保藏方法[J].河北化工，2010，33(4)：33-34.

[3]李向科，等.原料药发酵车间工程设计关键要素分析[J].医药工程设计，2013，34(4)：16-24.

[4]药品生产质量管理规范(2010年修订)，附录2[S].

[5]国家食品药品监督管理局药品认证管理中心，药品GMP指南（原料药）[M]，北京：2011.281-285.

[6]李素荣，等.抗生素菌种制备过程中染菌的防治[J].河北化工，2009，32(1).38-39.

[7]国家药典委员会.中国药典，第二部[M].北京：中国医药科技出版社，2010.附录 103.

On Layouts of Bacteria Room and Mould Testing Room in Fermentation Plant

Wu Shaohua, Dou Zhujie, Pan Houchang
（The Fourth Research and Design Engineering Corporation of CNNC Shijiazhuang, 050021）

Based on the requirements specified in 2010 Edition of GMP and combined with the characteristics of bacteria cultivation and sample examination, one idea for layout of bacteria room and mould testing room was presented in this article.

preparation of strain； culture preservation； mould test； clean environment

TQ 920.8

：A

：2095-817X（2015）03-0023-005

2014-12-30

吴少华（1985—），男，工程师，主要从事医药化工工程设计工作。