UPLC-MS/MS法测定烟草中12种常用农药残留量

熊 巍，韶济民，庞 夙，黄 玫，陶晓秋

UPLC-MS/MS法测定烟草中12种常用农药残留量

熊 巍，韶济民，庞 夙，黄 玫，陶晓秋*

（四川省烟草质量监督检测站，成都 640001）

为了实现烟草中常用农药残留量的快速筛查，建立了超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）快速分析烟草中12种农药残留量的方法，烟叶样品采用乙腈提取、PSA净化和UPLC-MS/MS分析测定。12种农药在低、中、高（2、200、500 µg/kg）3个加标水平的回收率范围为62.1%～126.3%，相对标准偏差（RSD）为0.6%～14.8%，检出限为0.24～4.24 µg/kg。本方法具有针对性强，检测时间短和灵敏度高的特点，能够很好的应用于烟草中常用农药残留量的快速分析检测。

液相色谱；串联质谱；烟草；农药残留

烟草中农药残留量的控制是保证烟草制品吸食安全的重要手段，近年来倍受人们关注。目前，在烟草生长过程中施用的农药种类主要有杀菌剂、杀虫剂、除草剂和抑芽剂。烟草中常用的杀菌剂有霜霉威、多菌灵、恶霜灵、甲霜灵、稻瘟灵和甲基硫菌灵；常用的杀虫剂有吡虫啉和辛硫磷，除草剂有异丙甲草胺；二甲戊灵、仲丁灵和氟节胺为烟用抑芽剂。鉴于农药残留对卷烟吸食安全性的影响，国际烟草科学研究合作中心（Cooperation Centre for Scientific Research Relative to Tobacco，CORESTA）于2003年提出对烟草中的99种农药指导性残留限量，并于2013年将指标扩充到120种，以上12种农药均被列入此名单。除多菌灵和辛硫磷外，其他10种农药均被列入中国烟叶公司2013年度烟草推荐使用农药名单，在各个烟区都有施用。由于这12种农药的施用广泛性和潜在的烟叶安全性，快速，准确的对其定量分析显得较为重要。

烟叶农药残留量的分析方法主要有气相色谱法（GC）［1］、气相色谱-串联质谱法（GC-MS/MS）［2-4］和液相色谱-质谱法（LC-MS/MS）［5-7］。2012年，杨飞等［8］利用LC-MS/MS同时检测了烟草及烟草制品中6种杀菌剂，此方法选取基质分散固相萃取处理样品。廖雅桦等［9］利用凝胶渗透色谱处理烟叶样品，高效液相色谱-串联质谱法测定了烟草中二甲戊灵、仲丁灵和马来酰肼等抑芽剂残留。陈晓水等［10］利用GC-MS/MS同时测定了烟草中的氟节胺等132种农药残留，此方法适合于有机磷、有机氯和菊酯类农药的检测。2011年，烟草行业制定一系列多农残检测标准，而这12种常用农药分列于2个检测标准，3种不同的检测方法［11-12］，使得检测过程较为复杂，繁琐。烟草常施用低毒类农药可能会超出指导限量，监测此类农药残留量尤为重要。

本研究针对烟草中常施用的12种农药指标，利用超高效液相色谱-串联质谱仪，同位素内标定量法，建立UPLC-MS/MS同时快速分析烟草中霜霉威、氟节胺等12种农药残留的方法。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

超高效液相色谱-串联质谱仪（Xevo TQ，美国Waters公司），配备电喷雾电离源；涡旋振荡器（VtexMixer 230VeU，美国Labnet公司）；离心机（Sigma 3K15，德国Sigma公司），无农药残留烟叶样品由CORESTA提供。

甲酸（HPLC级，浓度为49%～51%，德国Sigma公司）；乙腈（色谱纯，美国Thermo-Fisher公司）；霜霉威、多菌灵、吡虫啉、二甲戊灵、仲丁灵、恶霜灵、氟节胺、甲霜灵、异丙甲草胺、稻瘟灵、辛硫磷和甲基硫菌灵标准品来自于Labor Dr. Ehrenstorfer-Schafers（化学纯度≥98.5%，Augsburg，德国），内标二甲戊灵-d5，多菌灵-d4来自于加拿大TRC（化学纯度98%，同位素纯度98.9%和99.2%，多伦多，加拿大），甲基硫菌灵-d6购自CDN Isotopes Inc.（化学纯度98%，同位素纯度99.9%，Quebec Canada）。试剂包和N-丙基乙二胺（PSA）购自安捷伦公司（美国），水为超纯水。

1.2 标准溶液配制

用乙腈准确配置混合标准储备液（氟节胺为20 μg/mL，其他为5 μg/mL）储存于棕色玻璃瓶。用乙腈准确配置二甲戊灵-d5，（0.190 mg/mL），多菌灵-d4（0.099 mg/mL）和甲基硫菌灵-d6（0.099 mg/mL）氘带内标标准储备液。取一定量的各内标储备液进行混合，用乙腈稀释定容，制得混合内标标准储备液（10 μg/mL）。所有储备液都在-20 ℃冰箱保存，使用前将其恢复到室温。

1.3 样品的提取和净化

样品前处理方法主要参照已报道方法［11-13］，将500 g的烟叶样品粉碎均匀（100目），准确称取2 g烟末于50 mL离心管中，加入超纯水10 mL，振荡直至样品充分浸润，静置10 min。向离心管中加入10 mL乙腈，200 µL混合内标（10 μg/mL），涡漩振荡1 min（2000 r/min），0 ℃条件下保持10 min。然后向离心管中加入4 g无水硫酸镁和1 g氯化钠，1 g柠檬酸钠和0.5 g柠檬酸二氢钠，漩涡混振荡2 min（2000 r/min），离心10 min（4000 r/min）。

取1.0 mL上清液于1.5 mL离心管，加入150 mg无水硫酸镁及25 mg PSA吸附剂，漩涡振荡2 min（2000 r/min），然后离心2 min（6000 r/min）。吸取上清液过0.22 μm有机相滤膜，移取200 μL滤液，用超纯水稀释至1.0 mL，用于LC-MS/MS分析测定。

1.4 LC-MS/MS条件

色谱条件：Atiantis UPLC HSS T3（100 mm× 2.1 mm，1.8 m，美国Waters公司）；流动相A：0.1%甲酸水溶液（体积分数），流动相B：0.1%甲酸甲醇溶液；流速0.3 mL/min；柱温35 ℃；进样量10 µL。梯度洗脱条件：0～2 min，90% A～50% A；2～2.4 min，50% A～30% A；2.4～4.0 min，30% A～20% A；4.0～6.0 min，20% A～5% A，6.0～9.8 min，5% A～5% A；9.8～10.0 min，5% A～90% A，10.0～12.0 min，90% A～90% A。

质谱条件：电喷雾离子源，喷雾电压（IS）：2.6 kV；离子化温度350 ℃；雾化气流量：1000 L/Hr；锥孔气（cone）流量50 L/Hr；碰撞气流量为0.15 mL/min；碰撞气为氩气，其余气体为氮气；驻留时间为30 msec，正离子MRM模式采集，监测离子对及其相应的碰撞能量（CE）见表1。

表1 多反应监测模式下12种农药及其氘代内标的部分质谱参数Table1 Parameters of mass spectrometry for 12 pesticide residues and the internal standards in multiple reaction monitoring mode

2 结 果

2.1 标准曲线和检出限

本实验空白烤烟基质配制标准曲线，分别移取混合标准储备液（5 μg/mL，氟节胺20 μg/mL）0、20、50、100、200、500 μL于6个1.8 mL旋盖色谱瓶中，每个色谱瓶移入20 μL混合氘代内标工作液（10 μg/mL），加入200 μL空白烟叶样品萃取液，用乙腈定容至1 mL。各标准工作溶液的浓度分别为0、0.1、0.25、0.5、1.0、2.5 μg/mL。对各标样峰面积与内标的峰面积的比值（y）和其浓度（x）进行线性回归分析，得到标准曲线，结果见表2。各种化合物线性关系良好（除甲基硫菌灵外，其他化合物的相关系数r2≥0.99），可以满足定量分析的需要。以3倍信噪比确定方法的检出限，详见表2。混合标准品及加标样品的总离子流色谱图见图1。

2.2 方法的回收率及重复性

在农药残留量较低的烤烟样品中添加一定量的混合农药标准溶液，然后提取、测定，计算回收率。本实验选用20、200、500 µg/kg三种不同浓度的加标回收实验来考察方法的准确度，高、中、低每个水平做5个平行，计算5次结果的平均值为62.1%～126.3%。方法的精密度以回收率的相对标准偏差（RSD）来评价，对同一样品平行测定5次，12种农药的RSD范围为0.6%～14.8%，结果见表3。2.3 实际烟叶样本检测

测定了国内外19个烟叶样品中的12种农药残留量，结果表明，部分样品的仲丁灵，多菌灵，吡虫啉，稻瘟灵，甲霜灵，二甲戊灵，甲基硫菌灵和氟节胺有检出，其平均含量分别为0.329、0.518、0.146、0.130、0.077、0.419、0.558、0.201 mg/kg，其余农药未检出。所有样品的农药残留量均未超出CORESTA于2008年发布的指导性残留限量。

表2 12种农药的线性范围及检出限Table2 Linear equations and detection limits of twelve pesticide residues

图1 加标样品的选择离子流色谱图Fig.1 MRM chromatograms of a mixture of twelve pesticide residues ST and their corresponding IS in tobacco sample spiked with ST and IS.

3 讨 论

3.1 质谱条件的优化

三重四级杆质谱的锥孔电压和碰撞能（CE）对分析物的离子化过程有重要影响，采用与液相联机优化相关的离子源参数。采用针泵注射（5 µL/min）对目标物单独进样，将12种农药及3种内标（0.5 µg/mL）的标准溶液进行全扫，得到最大响应值的母离子，在子离子扫描（PI）模式下，调整CE找到该母离子对应的子离子，其中响应最高的锥孔电压和碰撞能量见表1。本实验比较了各分析物的单标和混标的信号强度及峰面积，单标和混标的响应值基本一致，表明这12种农药及其氘代内标离子间的抑制作用很弱。

3.2 色谱条件的优化

选取UPLC HSS T3，UPLC BEH Shield RP18和Atlantis dC18等色谱柱优化色谱条件，通过优化流动相与梯度洗脱条件，最终选取UPLC HSS T3作为12种农药的分析柱。为选择适宜的流动相，在ESI+模式下考察不同流动相体系，结果显示加入甲酸有助于部分农药的正离子化。在超纯水和甲醇中加入0.02%至0.5%的甲酸，在0.1%的添加量时响应最高，超过会出现基质抑制效应，当添加量为0.5%抑制效应较为明显。因此，选取0.1%甲酸水和0.1%甲酸甲醇体系作为本实验的流动相。选用了适当的梯度洗脱程序使得12种农药完全分离，整个梯度洗脱时间为12 min（图1）。

3.3 提取条件的选择

本实验分析的12种农药在2011年的烟草行业农药残留分析的系列标准中分属于两个不同的部分［12-13］，烟草及烟草制品多农药残留检测中采用的前处理中需要分散固相萃取和固相萃取净化。由于仪器检测灵敏度提高，使此方法只需要进行分散固相萃取后即可稀释进样检测。烟叶样品在经过乙腈萃取、PSA纯化后对于属于第三部分的农药如氟节胺和仲丁灵也有较好的回收率。

表3 烟草中12种农药的回收率和精密度 n=5Table3 Recovery of twelve pesticide residues in tobacco

3.4 基质和稀释的影响

样品基质的不同对农残的离子化效率有明显的影响，是分析结果准确性的重要影响因素。本实验选取空白烤烟基质，分别稀释0、2、5、10倍后加入一定量的混合标准品，与流动相加入标准品的色谱峰进行对比，分析各个化合物的基质效应和稀释效应。通过优化得到稀释倍数为5倍时可较好的降低基质效应又不会损失方法的灵敏度。

3.5 方法比较

本实验只关注了烟草生长过程中常用的12种农药，把分列于标准方法第一部分和标准方法第三部分（YC-T 405.3—2011）［12］的氟节胺，仲丁灵和二甲戊灵合并为一个方法检测，且本方法的检出限要显著低于标准方法（表2），有利于烟草常用农药残留量的快速检测。与标准方法（YC-T 405.1—2011）比［11］，本方法基于UPLC-MS/MS仪器，选取的色谱柱粒径更细，在较短的分析时间内显著提高了分离度，从而使得分析时间要明显短于标准方法（45 min）。

4 结 论

本研究对烟草中常用的12种农药的残留量进行了同时快速分析，采用基质分散固相萃取处理烟叶样品，氘代内标定量，UPLC-MS/MS分析检测，总分析时间为12 min。该方法具有针对性强，检测时间短和灵敏度高的特点，能够很好的应用于烟草中常用农药残留量的快速分析检测。

［1］ 石杰，杨静，刘惠民，等. 超声波提取-固相萃取净化-气相色谱法分析烟草中拟除虫菊酯类农药及氟节胺残留［J］. 分析试验室，2010（4）：22-24.

［2］ Li W， Lu C， Li H， et al， Determination of 49 pesticide residues in tobacco by gas chromatography-tandem mass spectrometry［J］. Chinese journal of chromatography，2010， 28（11）:1048-1055.

［3］ 楼小华，高川川，朱文静，等. PTV-GC-MS/MS 同时测定烟草中202种农药残留［J］. 烟草科技，2013（8）：45-57.

［4］ 楼小华，高川川，朱文静，等. GC-MS-MS法同时测定烟草中113种有机磷、有机氯及拟除虫菊酯类农药残留［J］. 中国烟草科学，2012，33（5）：83-89.

［5］ Mayer-Helm B. Method development for the determination of 52 pesticides in tobacco by liquid chromatography-tandem mass spectrometry［J］. Journal of Chromatography A， 2009， 1216（51）:8953-8959.

［6］ Mayer-Helm B， Hofbauer L， Müller J. Method development for the determination of selected pesticides on tobacco by high-performance liquid chromatography-electrospray ionisation-tandem mass spectrometry［J］. Talanta， 2008， 74（5）:1184-1190.

［7］ 严会会，胡斌，刘惠民，等. 高效液相色谱串联质谱法分析烟草中15种农药残留［J］. 烟草科技，2011（7）：43-47.

［8］ 杨飞，边照阳，唐纲岭，等. LC-MS/MS 同时检测烟草中的 6 种杀菌剂［J］. 烟草科技，2012（11）：45-50.

［9］ 廖雅桦，蒋腊梅，穆小丽， 等. 凝胶渗透色谱-高效液相色谱-串联质谱法同时测定烟草中3种抑芽剂残留［J］.分析试验室，2010，29（1）：72-75.

［10］ 陈晓水，边照阳，唐纲岭，等. 气相色谱-串联质谱技术分析烟草中的132种农药残留［J］. 色谱，2012，30（10）：1043-1055.

［11］ 中国烟草总公司. YC-T 405.1—2011 烟草及烟草制品多种农药残留量的测定 第1部分：高效液相色谱-串联质谱法［S］. 北京：中国标准出版社，2011.

［12］ 中国烟草总公司. YC-T 405.3—2011. 烟草及烟草制品多种农药残留量的测定 第3部分：气相色谱质谱联用及气相色谱法［S］. 北京：中国标准出版社，2011.

［13］ 熊巍，韶济民，张海燕，等. UPLC—MS/MS 测定植烟土壤中有机氯除草剂的残留量［J］. 烟草科技，2013（8）：29-32.

Determination of Twelve Common Pesticides Residues in Tobacco by Using Ultra Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

XIONG Wei， SHAO Jimin， PANG Su， HUANG Mei， TAO Xiaoqiu*
（Sichuan Tobacco Quality Supervision and Testing Station， Chengdu 640001， China）

In order to rapidly determine common pesticide residues in tobacco， a rapid method for determining twelve pesticides in tobacco using UPLC-MS/MS was developed. Samples were extracted by acetonitrile， cleaned up by dispersive solid-phase extraction and finally detected by UPLC-MS/MS. The results showed that the recoveries of twelve pesticides ranged from 62.1%-126.3% at the spiking levels of 20 µg/kg， 200 µg/kg and 500 µg/kg. The RSD ranged from 0.6%-14.8%， and the LOD was from 0.24 µg/kg to 4.24 µg/kg. For the superior sensitivity， targeted residues and shorter analysis time， this method was suitable for the rapid analysis of common pesticide residues in batches of tobacco samples.

liquid chromatography； tandem mass spectrometry； tobacco； pesticides residue

S572.01

1007-5119（2015）01-0005-05

10.13496/j.issn.1007-5119.2015.01.002

四川省烟草专卖局（公司）科技计划项目（201301003）

熊 巍，男，硕士，助理工程师，主要从事烟草、土壤化学分析工作。E-mail：xiongwei199@aliyun.com *通信作者，E-mail：txq@sctobacco.com.cn

2014-08-07

2015-02-25