烤烟根系分泌物降解液对烤烟幼苗根系和光合特性的影响

李 鑫，周冀衡，宾 俊，王 丰

（1.湖南农业大学生物科学技术学院，长沙410128；2.湖南农业大学烟草研究院，长沙 410128；3.黔西南州烟草公司，贵州 兴义 562400）

烤烟根系分泌物降解液对烤烟幼苗根系和光合特性的影响

李 鑫1，2，周冀衡2，宾 俊1，2，王 丰3*

（1.湖南农业大学生物科学技术学院，长沙410128；2.湖南农业大学烟草研究院，长沙 410128；3.黔西南州烟草公司，贵州 兴义 562400）

从烤烟根系分泌物中筛选出能够有效降解烟碱和水杨酸等主要成分的赖氨酸芽孢杆菌和寡养单胞菌两种细菌，以5 mL菌液和45 mL分泌物混合施入育苗盘中进行幼苗培养并测定和分析其对烤烟幼苗光合特性、叶绿素荧光特性、叶绿素含量和幼苗根系生长的差异。结果表明，含有降解菌的处理液可提高幼苗生长过程中的光合作用，促进根系生长，同时含寡养单胞菌和赖氨酸芽孢杆菌的处理液对烤烟根系分泌物降解效果最佳，只含有降解水杨酸的寡养单胞菌和赖氨酸芽孢杆菌的降解液处理次之，不含降解菌的处理液对烤烟幼苗生长有抑制作用。盆栽试验中，两种菌均能够降低烤烟根系分泌物对烤烟生长的抑制作用，当两种菌混合后效果最好。

烤烟根系分泌物；连作障碍；幼苗生长；降解

烤烟是我国重要的经济作物［1，2］，连作是当前烟草的主要种植模式之一［3］。众所周知，烤烟连作会导致障碍作用，而造成烤烟连作障碍的一个主要原因是根系向土壤及周边环境分泌若干有毒物质，直接抑制和危害烤烟生长，导致植烟土壤中有害真菌群数量增加，有益细菌、放线菌等微生物的种类和数量降低［4-6］。严重时会出现烟叶长势、叶生物量、外观质量和内在品质不同程度的降低。高欣欣等［7］研究认为，烤烟根系分泌物中多种物质可以降低烤烟种子的萌发；郭亚利等［8］研究认为烤烟连作可以导致烤烟根系对硝酸根离子、磷酸根离子和钾离子的吸收；田伟等［9］研究认为根系分泌物在抑制烟草生长发育，增加烟草黑胫病发病率等方面效应非常明显。

目前大多数学者将根系分泌物中的物质分为低分子有机化合物、高分子粘胶物质、细胞或组织脱落物质溶解产物以及质子和无机离子［10］，其中以低分子的有机物质含量最多，诸如苯甲酸、水杨酸、烟碱等［11-15］低分子有机物的影响效果最明显。现阶段，关于解决烤烟连作障碍的研究主要集中在改良土壤肥力和环境，如轮间套作［16］、水肥耦合［17］、稻草还田［18］等常规的农业措施，而在降解烤烟根系分泌物对连作障碍的响应机制及调控方面研究较少。为此，笔者从烤烟根系分泌物中提取筛选出两株降解作用效果较好的降解细菌，研究其对烤烟根系分泌物浇灌处理烟苗根系发育状况和光合特性的影响，进而为解决连作植烟土壤的大田自毒作用提供理论依据和实践基础。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试烤烟品种为K326（Nicotiana tobacum L. K326），由贵州省烟草科学研究院提供。降解菌为能够降解烟碱的赖氨酸芽孢杆菌（Lysinibacillus sphaericus）和能够降解水杨酸的寡养单胞菌（Stenotrophomonas sp.）。两种降解细菌均是在前期试验研究中获得，其中寡养单胞菌的分离、鉴定已发表［19］。

1.2 试验方法

1.2.1 降解液的制取 两种降解菌经平板培养后在无菌操作下接种到液体营养培养基中，在30 ℃的培养箱中培养36 h后在4 ℃冰箱中冷藏备用。

1.2.2 烤烟根系分泌物的收集和提取 根系分泌物提取在贵州省烟草科学研究院福泉基地完成，提取时间为2013年7月16日—8月1日。选取长势良好，未染病，生长一致的K326品种成熟烟株，将其根部洗净后分别置于装有20 L去离子水的木桶中培养，每天加去离子水至20 L，用80 W电磁式空气泵（ACO-003型，上海楚柏实验室设备有限公司）进行通氧培养，每24小时更换1次烟株，连续更换10次。将收集的根系分泌物溶液过滤（0.45 μm）后用旋转蒸发仪（RE-5205型，上海洪纪仪器设备有限公司）在60 ℃下浓缩10倍，最后在-20 ℃冰箱中冷藏备用。去离子水由试验用去离子超纯水机（东莞市纳百川水处理设备有限公司提供）生产。

1.2.3 试验设计 幼苗生长试验于2013年8月至2013年10月在贵州省烟草科学研究院人工大棚中进行，采用常规育苗盘育苗，育苗基质由云南省丘北县烟用物资有限责任公司提供。8月1日开始播种，育苗15 d后间苗（8月15日），每穴留1株烟苗，每天下午6:00向育苗盘中浇入50 mL相应处理液，连续灌浇45 d，含有降解菌的处理液在浇入前12 h即在常温下混匀。采用随机区组设计，共设5个浇灌液处理，每个处理3个重复（即3盘幼苗），每个重复12株烟苗。5个处理分别为T1（CK）：普通浇灌水；T2：烤烟根系分泌物；T3：赖氨酸芽孢杆菌和烤烟根系分泌物的混合液；T4：寡养单胞菌和烤烟根系分泌物的混合液；T5：赖氨酸芽孢杆菌和寡养单胞菌与烤烟根系分泌物的混合液。T3、T4和T5处理的混合液以降解菌液5 mL，分泌物45 mL进行分配。待幼苗生长60 d（10月1日）后测量其光合特性、根系结构和叶绿素荧光等各类指标。

1.3 测定项目与数据分析

选取长相一致具有代表性的烟苗根系，采用WinRHIZO植物根系扫描分析系统（北京易科泰生态技术有限公司）测定幼苗根系结构。采用Li-6400XT便携式光合作用测定仪和6400-02B红蓝光源（美国Li-cor公司）测定幼苗光合指标。采用M系列IMAGING－PAM（WALZ，德国）调制叶绿素荧光成像系统，选择烟苗第2～3片叶自上而下进行叶绿素荧光动力学参数的测定。采用丙酮提取—TU1901紫外分光光度计测定幼苗叶绿素各类指标。

试验数据采用Microsoft Excel 2003软件进行处理，采用SPSS18.0软件进行差异显著性分析。

2 结 果

2.1 不同处理对烤烟幼苗根系的影响

从表1看出，各处理间以施入普通浇灌水T1处理的烤烟幼苗根系表现最好，根系生长优于其他含有根系分泌物的处理。同时研究分析发现，含有赖氨酸芽孢杆菌和寡养单胞菌两种菌的根系分泌物处理T5对幼苗根系的生长优于只含有单一降解菌的根系分泌物的T3和T4处理以及无降解菌液的根系分泌物处理T2。说明根系分泌物对烤烟根系生长具有抑制作用，加入降解菌后能够在一定程度上减轻这种抑制作用，且添加的降解菌种类越多，其抑制作用越弱。

2.2 不同处理对烤烟幼苗叶绿素含量的影响

由表2看出，叶绿素各指标通过不同处理液浇灌后以T1处理为最大，其次是含有两种降解菌液的根系分泌物处理T5。T5处理与只含有根系分泌物的T2处理间存在差异，且叶绿素a含量差异显著，其他指标间差异不显著；含有单一菌液的根系分泌物T3处理和T4处理中的叶绿素各指标均大于处理T2，但差异不显著。总体而言，叶绿素含量以T1＞T5＞T3≈T4＞T2。

2.3 不同处理对烤烟幼苗光合特性的影响

从表3看出，含单一降解菌处理液的T3和T4处理相比T2处理均对烤烟光合特性有一定程度的促进作用，两处理均比T1处理的光合特性弱，但比只含有根系分泌物的T2处理强。其中，不同处理的叶片净光合速率T1处理最大，其次是降解菌混合处理液T5处理、寡养单胞菌降解处理液的T4处理和赖氨酸芽孢杆菌降解处理液的T3处理，而只含有根系分泌物的T2处理净光合速率最低，T1处理与其他处理间均有差异；不同处理液的气孔导度和蒸腾速率表现趋势类似，T1处理均比其他处理液高，T2处理最低，T5处理要比T3和T4处理降解效果好；胞间CO2浓度的测定中混合降解菌处理液的T5处理和T3处理以及T4处理不存在显著差异。

2.4 降解菌对烤烟幼苗叶绿素荧光特性的影响

植物叶绿素荧光信号能快速灵敏地反映植物生理生态及其与环境的关系，是一种理想光系统探针［20］，通过荧光参数分析可直接或间接了解光合机构内部一系列重要的调节过程，是研究光合代谢的新手段［21］。从表4可以看出，叶绿素荧光特性的各指标在T1处理中为最大，含有根系分泌物的处理均降低了烤烟幼苗的叶绿素荧光特性，只含有根系分泌物的T2处理最小。同时研究发现，根系分泌物中含有降解菌液的处理能够有效降低根系分泌物对烤烟幼苗叶绿素荧光特性的抑制，降解菌种类越多，烤烟根系分泌物对幼苗叶绿素荧光特性的抑制程度越弱；分泌物中含有单一的寡养单胞菌的T4处理要比含有单一赖氨酸芽孢杆菌的T3处理抑制作用更弱。

表1 不同处理对烤烟幼苗根系的影响Table1 Effects of different treatments on flue-cured tobacco roots

表2 不同处理对烤烟幼苗叶绿素含量的影响 mg/gTable 2 Effects of different treatments on chlorophyll content of flue-cured tobacco mg/g

表3 不同处理对烤烟幼苗光合特性的影响Table 3 Effects of different treatments on photosynthetic characteristics of flue-cured tobacco

表4 两种降解菌对烤烟幼苗叶绿素荧光特性的影响Table 4 Effects of different treatments on chlorophyll fluorescence parameters of flue-cured tobacco

3 讨 论

连作障碍是指同一作物或近缘作物连作以后，即使在正常管理情况下，也会产生产量降低、品质变劣、生育状况变差的现象［22］。连作障碍往往会导致病虫害加重、土壤次生盐渍化及酸化、植物自毒作用和元素平衡破坏等［23］。Asao T等［24］认为导致烤烟连作障碍的一个重要原因是由于本身的自毒作用，由于连年种植，导致烤烟根系会分泌一些自毒物质并积累，达到一定程度会抑制烤烟生长。化感物质可以对受体植物的细胞分裂、膜功能、光合作用和生物合成等生理生化反应产生影响［25］。本试验选取能够降解烟碱和水杨酸的微生物与烤烟根系分泌物混合定量施加到生长的烤烟幼苗中并测定K326烤烟幼苗光合特性、根系结构、叶绿素荧光特性以及叶绿素含量的变化，反映出烤烟根系分泌物中化感物质对幼苗期烤烟化感作用的生理生化机制和降解菌液的降解效果。

不同种类微生物对烤烟连作障碍降解的程度有所不同，但总体抑制作用占主导。降解菌多以节杆菌属（Arthrobacter）［26］和假单胞菌属（Pseudomonas）［27］两类细菌为主，对水杨酸和烟碱有降解作用的微生物目前已有恶臭假单胞菌H2-3（P.putica）［28］、产碱杆菌（Alcaligenes）［29］，烟草节杆菌（Arthrobacter nicotianae）［30］和噬烟碱节杆菌（Arthrobacter niotinovorans）［31］等，它们可以将土壤或溶液中的多种物质分解转化为羧中的水杨酸。降解菌液可将根系分泌物中的水杨酸和烟碱降解转化为自身生长所需碳源、氮源和能源，从而达到降解有毒废物的目的［19，32］。本试验结果表明，含有降解菌液的处理对烤烟化感作用都有降解效果，寡养单胞菌的降解效果优于赖氨酸芽孢杆菌。

本文只研究了两种降解菌对烤烟幼苗期的化感降解作用，要想有效解决大田烤烟连作土壤的障碍作用，还需研究更多种类和数量的微生物以及对成熟烟株调制后的烟叶质量和产量影响，其具体降解措施有待进一步研究。

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Effects of Degradation Bacteria Suspension against Flue-cured Tobacco Root Exudates on Root Structure and Photosynthetic Features of Flue-cured Tobacco Seedlings

LI Xin1，2， ZHOU Jiheng2， BIN Jun1，2， WANG Feng3*
（1. Hunan Agricultural University， Changsha 410128， China； 2. College of Tobacco Research， Hunan Agricultural University，Changsha 410128， China； 3. Qianxinan Tobacco Company， Xingyi， Guizhou 562400， China）

Two Lysine Bacillus and Stenotrophomonas strains were previously selected from exudates of flue-cured tobacco to be able to depredate effectively nicotine， salicylic acid and other secretions. A mixture of 5ml bacterial suspension and 45 mL secretions was added into the seedling trays to test their effects on flue-cured tobacco seedling photosynthetic characteristics， chlorophyll fluorescence characteristics， chlorophyll content and root growth. The results showed that the exudates containing degrading bacteria could improve photosynthesis during the process of seedling growth， and promote the growth of root. The degradation effect of flue-cured tobacco root exudates containing both Stenotrophomonas Bacillus and Lysine bacteria was the best， followed by the degradation solution that only contained Lysine Bacillus or Stenotrophomonas strains， and that the treating solution without degrading bacteria inhibited the growth of flue-cured tobacco seedlings. In the pot experiment， both bacteria were capable of reducing the inhibition of tobacco growth by root exudates， with the best effect observed when both bacteria were used.

root exudates of flue cured tobacco； continuous cropping obstacles； seedling growth； degradation

S572.04

1007-5119（2015）04-0045-05

10.13496/j.issn.1007-5119.2015.04.008

中国烟草总公司贵州省烟草公司项目“烤烟根系分泌物中酚酸及其对烟苗光合特性的影响”（201232）；湖南省研究生科研创新项目“基于烤烟土壤-根系互作机制的烟叶钾素调控技术研究”（CX2015B238）

李 鑫（1989-），男，在读博士，研究方向：烟草生物科学与工程技术。E-mail：s2007203272@yeah.net

*通信作者，E-mail：yancaowangfeng@163.com

2014-11-30

2015-06-17