冬虫夏草菌人工培养研究进展

黄宝菊，王 忠，李 菲，黄雪峰，郑方毅

［安发(福建)生物科技有限公司 352100］

冬虫夏草是真菌界子囊菌纲肉座菌目麦角菌科冬虫夏草属的冬虫夏草菌，冬虫夏草为冬虫夏草属冬虫夏草菌寄生在蝙蝠蛾幼虫上的具有成熟子囊壳的子座及蝙蝠蛾幼虫尸体的复合体［1］，是国家Ⅱ级保护物种［2］，其药性温和，老、少、病、弱、虚者皆宜，可以降低血液中的胆固醇和甘油三酯，提高对人体有利的高密度蛋白，减轻动脉粥样硬化。冬虫夏草还具有直接抗病毒、调节中枢神经系统功能和调节性功能等作用。入肺、肾二经，甘温不燥，能滋肺补精益气，具有补虚损、抗癌症、抗衰老，增强人体免疫功能的作用。

野生冬虫夏草生长周期长达数年，且近年来对野生冬虫夏草的滥挖滥采已严重破坏草原生态环境或造成野生冬虫夏草濒临灭绝。因此，人工栽培冬虫夏草成为必然趋势。我国从20世纪70年代末开始陆续对冬虫夏草菌进行人工栽培，冬虫夏草菌的固体培养、液体发酵培养已被广泛研究。随着冬虫夏草菌的深入研究，冬虫夏草菌周期短，繁殖速度快;李增智等对部分冬虫夏草菌进行了分子生物学上的基因组DNA指纹图谱检测，发现其与野生冬虫夏草的相似度高达96%［3］;发酵菌丝体与野生冬虫夏草含有的化学成分在含量上稍有差别，但成分总体上基本保持不变［4］，冬虫夏草菌菌丝体将成为野生冬虫夏草的最佳替代品。但人工仿生栽培冬虫夏草，由于寄主蝠蛾生长周期长、易遭受病害侵袭，产量低且生产成本高，难以获得理想效果，因此其产业化发展仍存在很大的障碍。本文综述了冬虫夏草菌的分离纯化培养、人工固体培养、人工液体发酵条件的研究进展，为进一步深入探究冬虫夏草菌人工栽培及产业化发展提供参考。

1 分离纯化培养

冬虫夏草菌可以由子座、菌核和虫体等组织分离得到。在无菌条件下，将冬虫夏草进行分离，接种于特定培养基中，分离后的菌株进行纯化培养，即得到纯种冬虫夏草菌。

王忠等［5］将采集的冬虫夏草进行分离，得到冬虫夏草菌无性型——中国被毛孢，其菌丝为白色，菌苔灰白色，菌落茸状、圆形，气生菌丝发达，菌丝体具有鲜香菇气味。刘锡琎等［6］对康定收集的冬虫夏草分为子座、柄和虫体三部分进行分离培养，得出冬虫夏草菌是一种嗜较低温度的真菌，15～20℃为其生长适温，25℃以上则抑制生长。分离纯化后，在中心部分出现极为稀疏的白色菌丛，是冬虫夏草菌的菌丝体和分生孢子。经过特殊处理，能够产生较多的菌丝体和分生孢子，某些特殊培养基上既可产生高达2～3 cm似蚯蚓粪泥状的隆起黄褐色子座组织，也可以长出丰茂白色的含分生孢子的菌落。

2 人工固体培养

固体培养是指用固体培养基生产菌种或获得菌丝体及其代谢产物的培养方法，具有成本低、过程易控、生长周期较短等优点。将冬虫夏草菌分离纯化后得到的纯种接种到固体培养基上，生长出冬虫夏草子实体且具有成熟子囊壳的人工培育，为全人工栽培［7］。冬虫夏草菌的培养随着培养基的不同，其培养条件亦有所不同，吴彩琴等［8］以豆粕和米糠为固态培养基，初步确定了在豆粕∶米糠为1∶2(W/W)的固体培养基上发酵产生的冬虫夏草多糖的最佳条件为:接种量20%、温度26℃、培养基含水量60%、空气相对湿度60%及培养时间7 d。葛飞等［9］进行固体发酵培养中国被毛孢的正交试验，结果表明最佳固态发酵培养基组合为:大米5 g、玉米粉2 g、蝉蛹粉1 g、麸皮2 g;进行固体发酵培养中国被毛孢的单因素试验，结果表明最佳固体发酵条件为:温度20℃、料水比1∶1.5、料层厚度2 cm、无光照。菌丝体中麦角甾醇优化后比优化前提高了38.6%。王祥诚等［10］以蕨渣为主要原料，采用正交试验设计对产生菌质多糖的工艺条件 (基质蕨渣比例、基质含水量和培养基温度)进行了初步的优化，优化得出冬虫夏草菌发酵生产蕨渣菌质多糖的最佳培养条件:蕨渣比例85%、基质含水量60%、培养基温度22℃。

冬虫夏草菌的培养随着碳源、氮源的不同，其生长状况亦存在差异，张安宁等［11］在不同碳源、氮源培养基上以生长面积和生长情况为指标，得出中国被毛孢的生长的最适碳源为葡萄糖和蔗糖，最适氮源为蛋白胨、酵母膏和脱脂奶粉。周宇爝等［12］研究不同氮源的培养基对中国被毛孢的生长速度和总生物量的影响，结果表明氮源对菌丝体生物量的影响依次为:黄粉虫蛹粉＞牛肉蛋白胨＞黄粉虫粉＞蛋白胨＞大豆。

综上所述，冬虫夏草菌的适宜生长温度为20～26℃，培养基含水量为60%;适宜的微量元素有利于菌丝体的生长;碳源、氮源对菌丝体均有所影响。目前固体培养以冬虫夏草菌生长面积和生长情况为指标研究最佳条件的试验居多，以冬虫夏草菌有效成分为指标研究最佳生长条件的研究较少。若在固体培养冬虫夏草菌有效成分的提高方面进行深入研究，将有助于固体培养冬虫夏草菌在替代冬虫夏草的研究道路上取得更大突破。

3 人工液体发酵培养

液体培养是指用液体培养基生产菌种或获得菌丝体及其代谢产物的培养方法，具有成本低、发酵产物易于开发利用、发酵过程条件易控、生长周期较固体培养时间更短、生产效率高等优点。从生物学角度看，虫草真菌在液体培养基中发酵时能够产生大量有药用价值、经济价值的菌丝，保证药用物质的来源并缓解野生冬虫夏草资源紧张的现状。

刘欣等［13］对中国被毛孢YS－08－4菌株的液体培养基进行了优化研究，筛选出中国被毛孢菌YS－08－4菌株优化发酵培养基的最佳配方为氮源A 60%、H2PO40.23%、氮源 B2%、葡萄糖2.71%。尚德静等［14］对冬虫夏草菌的深层培养条件进行研究，明确了冬虫夏草菌深层发酵的最适培养条件应为温度24℃、摇床转速200 r/min、pH值5.0左右，接种量5%～15%，菌丝生长的最佳碳源为葡萄糖、最佳氮源为蛋白和氨基酸复合粉、最佳无机盐为磷酸二氢钾、硫酸镁和氯化钙。张忠广等［15］对冬虫夏草菌种的液体发酵培养条件进行研究，筛选最佳培养基组合为土壤浸出液 (1∶1)25 mL、脱脂牛奶25 mL、牛肉蛋白胨1.3 g、无菌水200 mL、葡萄糖3.8 g、磷酸二氢钾0.18 g、硫酸亚铁0.1 g。在装量40%、pH值5.5、温度18～20℃、摇床转速100～120 r/min、培养96 h条件下，菌丝体产量较高，达到0.02 g/mL。

李邦良等［16］申请了一种用于生产冬虫夏草菌丝体的培养基专利，其斜面培养基配方为葡萄糖1.0%～3.0%、玉米粉 0～2.0%、土豆汁 0～1.0%、酵母粉0.1% ～1.0%、糊精0～1.0%、麸皮0.5%～2.0%、蚕蛹粉1.0%～3.0%、蛋白胨0～2.0%、硫酸镁0～0.05%、磷酸二氢钾0～0.05%、琼脂粉0.5%～1.0%，其余为水;发酵培养基配方为葡萄糖1.0% ～1.5%、玉米浆0～1.0%、蚕蛹粉0.5%～1.0%、糖蜜1.0%～1.5%、黄豆饼粉1.0% ～2.0%、酵母膏0.5% ～1.0%、硫酸镁0～0.05%、磷酸二氢钾0～0.05%，其余为水。杜晓蒙等［17］利用Plackett－Burman(PB)试验设计筛选出影响冬虫夏草菌生长的关键培养基成分，然后利用最陡爬坡试验和中心组合设计试验优化和确立最佳培养基配方组合，结果表明，葡萄糖、酵母粉和KH2PO4对冬虫夏草菌的生长影响显著，优化后的培养基成分为葡萄糖59.35 g/L、蛋白胨10 g/L、酵母浸粉16.83 g/L、KH2PO41.47 g/L、MgSO4·7H2O 0.1 g/L，利用此培养基培养获得的冬虫夏草菌丝体产量为26.86 g/L，是优化前的2.5倍。罗园香等［18］以菌丝体干质量、胞内多糖含量及腺苷含量为指标，进行冬虫夏草菌的液态发酵条件研究，确定利用葡萄糖蛋白胨液体培养基发酵生产菌丝体、胞内多糖及腺苷的最佳条件为装液量100 mL/500 mL、接种量3%、温度24℃、培养时间4 d、摇床转速140 r/min;试验得到菌丝体干质量为17.232 g/L、胞内多糖含量为78.34 ng/g、腺苷含量为633.7 ug/g。

综上所述，冬虫夏草菌栽培的适宜温度为18～24℃;培养基含水量为60%;适宜的微量元素有利于菌丝体的生长;碳源、氮源对菌丝体均有所影响;摇床适宜转速为100～200 r/min;动物性氮源较佳;pH值为5.0～7.0;不同培养条件的冬虫夏草菌所含有效成分不同。虽然冬虫夏草菌液体发酵技术取得好的进展，但在评价指标体系方面还未形成统一标准。

4 研究展望

目前，冬虫夏草菌巨大的市场潜力正在迅速转变为市场需求，但冬虫夏草产业化发展中存在产量低、成本高、工厂化模式生产不成熟、寄主蝠蛾生长周期长、易遭受病害侵袭等问题，而人工液体栽培有着无可替代的优势，其培养成本低、周期短、繁殖速度快，是今后冬虫夏草菌人工栽培研究的主要方向。试验结果表明，采用发酵的方法大量生产冬虫夏草菌丝体来代替天然冬虫夏草，无论从理论上还是技术上都得到了一定的支持［19－25］。发酵法生产冬虫夏草菌丝体已成为今后的一个发展趋势，对保护日益减少的冬虫夏草生态资源具有重要的意义，可为逐渐增长的市场需求提供行之有效的解决方法。

在工业化液体发酵培养上，应注意一些不容忽视的问题:为确保发酵冬虫夏草菌丝体的食用、药用价值，需提供一个最适合真菌产生的工业发酵条件及优良菌种的筛选条件;当菌种应用于规模化发酵生产后，解决菌种退化与变异问题是重中之重。目前冬虫夏草菌的统一标准尚未形成，有待进一步完善。有性型冬虫夏草人工培育的工业化有待加快步伐。

［1］梁宗琦.中国真菌志:冬虫夏草属 (第三十二卷)［M］.北京:科学出版社，2007.

［2］陈仕江，钟国跃，马开森.珍稀名贵药材冬虫夏草资源可持续利用的思考与建议［J］.重庆中草药研究，2006(2):8－10.

［3］李增智，黄勃，李春如，等.确证冬虫夏草无性型的分子生物学证据L中国被毛孢与冬虫夏草之间的关系［J］.菌物系统，2000，19(1):60－64.

［4］黄丽俊，李利东，袁建新，等.冬虫夏草研究现状及展望［J］.农学学报，2014，4(8):63－65.

［5］王忠，马启龙.甘肃冬虫夏草菌分离培养研究［J］.甘肃农业科技，2001(7):43－44.

［6］刘锡琎，郭英兰，俞永信，等.冬虫夏草菌无性阶段的分离和鉴定 ［J］.真菌学报.1989(8):35－40.

［7］宋宇琪，王蕾，郭素萍.冬虫夏草菌及其菌丝体的研究进展［J］.科技情报开发与经济，2008，18(29):98－99.

［8］吴彩琴，陈野，郝迎.固体发酵生产冬虫夏草多糖的研究［J］.食品科学，2009(7):186－189.

［9］葛飞，桂琳，李春如，等.冬虫夏草无性型—中国被毛孢固态发酵条件的初步研究 ［J］.生物学杂志，2009(3):22－25.

［10］王祥诚，余有贵，程里，等.冬虫夏草固态发酵蕨渣生产菌质多糖［J］.食品研究与开发，2010，31(7):148－150.

［11］张安宁，袁书林，孙林超，等.4种虫草真菌生长适宜碳、氮源的研究［J］.江苏农业科学，2011，39(6):404－406.

［12］周宇爝，江明艳，姜福星，等.不同氮源对中国被毛孢生长的影响［J］.广东农业科学，2013，40(18):22－24.

［13］刘欣，张宗豪，徐海峰，等.冬虫夏草菌液体发酵培养基的优化研究［J］.食用菌，2013(1):14－16.

［14］尚德静，王孝敏.冬虫夏草深层发酵的研究［J］.中国食用菌，1996，15(6):48－49.

［15］张忠广，乔正强，柳慧玲，等.冬虫夏草菌液体发酵培养试验初报［J］.食用菌，2006(增刊):25－31.

［16］李邦良，许静，王珍，等.一种用于生产冬虫夏草菌丝体的培养基 ［J］.中国.101096641［P］.2008－01－02.

［17］杜晓蒙，孙海龙，崔建东.培养基成分对冬虫夏草菌的生长的影响及其优化 ［J］.中国酿造，2011(3):72－74.

［18］罗园香，盛嘉俊，叶克难.一株冬虫夏草菌的液态发酵条件研究［J］.中国酿造，2015(4):78－81.

［19］赵锦，王宁，陈月琴，等.冬虫夏草无性型的分子鉴别［J］.中山大学学报:自然学报版，1999，38(1):123－125.

［20］王宁，陈月琴，章卫民，等.虫草属多元起源的分子生物学证据［J］.中山大学学报:自然科学版，2000，39(4):70－73.

［21］章卫民，李泰辉，等.西藏冬虫夏草无性型的分子生物研究［J］.微生物学通报，2002，29(3):54－58.

［22］蒋毅，姚一建.虫草属分子系统学研究现状［J］.菌物研究，2004，2(1):58－67.

［23］李伯辉，童应凯，等.冬虫夏草液体深层发酵中试试验［J］.食品研究与开发，1997(3):17－18.

［24］张忠广，乔正强，等.冬虫夏草液体发酵培养实验初报［J］.食用菌，2006(Z):25，31.

［25］吴玲芳，王晓瑞，等.冬虫夏草液体发酵培养的研究进展［J］.发酵科技通讯，2014，43(4):25－29.