三种去除非全长cDNA片段方法的比较研究

田 飞，李翠新，何 德

（西南林业大学，云南 昆明650224）

1 引言

在构建全长cDNA文库时，连接和转化是关键步骤。在做样品与载体连接之前，去除由PCR扩增不完全和限制性内切酶酶切产生的非全长cDNA片段是必不可少的工作，残留的非全长cDNA片段会直接影响连接效果，影响建成文库的代表性、冗余度和挑取单克隆测序的工作量[1～3]。而SMART技术中去除非全长cDNA片段的方法也由其创立的CLONTECH公司从2001年的胶回收法[4]，改为 CHROMA－SPIN 400柱重力自流法，而在近几年又改为CHROMA－SPIN 400柱离心法。然而多年来广大的科研工作者大多数只是对其提供的去除方法进行延用，却没有见到对这3种方法进行平行比较和取舍的研究报道[5，6]。本文作者通过实验发现最新的CHROMA－SPIN 400柱离心法的纯化效果并不理想，所以对这3种方法做了一个综合比较，以期得到最经济有效的纯化方法，为后继实验者提供指导和参考。

2 实验材料与方法

2.1 实验材料

小桐子花采自云南省昭通市巧家县。琼脂糖购自BIOWEST公司，胶回收试剂盒购自OMEGA公司，CHROMA－SPIN 400柱购自CLONTECH公司，PCR仪购自 BIORAD公司，型号为 C1000TM Thermal cycler，枪头和离心管购自美国Labnet公司，其他试剂均为国产分析纯。

2.2 扩增并酶切cDNA

将反转录得到的cDNA用PCR仪扩增后，取160μL扩增液，用SfiⅠ限制性内切酶酶切处理，备用。具体操作参照 CLONTECH 公司的 CreatorTMSMARTTMcDNA Library Construction Kit说明书。

2.3 胶回收法纯化

取50μL酶切过的PCR扩增液跑琼脂糖凝胶电泳，用胶回收试剂盒做胶回收，胶回收液标记为1号处理液，－20℃冰箱中保存备用。

2.4 CHROMA－SPIN 400柱重力自流法纯化

取20个灭菌处理过的2mL离心管，编号1到20。从冰箱中取出一支CHROMA－SPIN 400柱，室温放置1h活化，颠倒数次后垂直放置于一支架上，让管中的树脂重新沉降成柱。30min后，待树脂柱上表面清晰可见，掰断舍弃尾，揭开顶盖，排出柱中缓冲液，再往柱中添加TE缓冲液冲洗依次，待尾管处停止滴液后，给尾管套上白尾套。取50μL酶切过的PCR扩增液，小心加到树脂上表面的中心位置。待样品液完全被树脂柱吸收后，打开尾管，用移液枪往柱中滴加TE缓冲液冲洗，并立刻用标记好的离心管依次放于尾管下承接洗脱液，每管接一滴，直至接满20管。立即做琼脂糖凝胶电泳检测，合并最早出现条带的前三管洗脱液，标记为2号处理液，－20℃冰箱中保存备用。

2.5 CHROMA－SPIN 400柱离心法纯化

从冰箱中取出一支CHROMA－SPIN 400柱，室温放置1h活化，颠倒数次后垂直放置于一支架上，让管中的树脂重新沉降成柱。沉降完全后，掰断舍弃尾，并迅速套上一个配套的收集管，揭开顶盖，700g，离心5min。将收集管连同管中的收集液一起丢掉，拿一个新的配套收集管给纯化柱套上，取50μL酶切过的PCR扩增液，小心加到树脂柱上表面的中心位置，700g室温离心5min，纯化好的cDNA样品即在新的收集管中。取出纯化柱，给收集管盖上盖子，标记为3号处理液体，－20℃冰箱中保存备用。

2.6 浓缩纯化液体至等体积

为控制变量，将3份纯化液浓缩至等体积。具体方法为往3份纯化液中各添加1／10倍体积3mol／L的NaAc，1.3μL浓度为20μg／μL的糖原溶液和2.5倍体积－20℃预冷的95%乙醇，摇晃混匀后置于－20℃冰箱中冷冻1h助沉。1h后取出离心管，14000g室温离心20min。用枪头小心吸去上清，再添加100μL80%的乙醇震荡洗涤一次。14000g低温离心后，吸去乙醇层，酒精灯旁晾干沉淀，再均以7μL RNase－free水溶解沉淀。

3 结果与分析

3.1 CHROMA－SPIN 400柱重力自流法电泳检测结果

CHROMA－SPIN 400柱重力自流法的20管洗脱液，每管取3μL，用琼脂糖凝胶电泳检测。结果如图1所示，含有样品的洗脱液出现在15、16、17、18四管中，而且这四管洗脱液的条带在500bp处都有一细窄的亮带，是由急剧的cDNA含量减少造成的，说明CHROMA－SPIN 400柱重力自流法让样品液中小于500bp的cDNA片段的量有了明显的减少。

图1 CHROMA－SPIN 400柱重力自流法洗脱液检测电泳图

3.2 三份处理液浓缩至等体积后电泳检测结果

取1、2、3号浓缩液和未处理的酶切过的RT－PCR扩增液各3μL做琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图2。

图2 三种方法纯化液浓缩至等体积后电泳图

3种方法的处理液电泳检测都有条带，CHROMA－SPIN 400柱离心法的条带与胶回收法的条带亮度接近，说明这两种方法回收率接近，都较低，且都显著低于CHROMA－SPIN 400柱重力自流法的回收率。而从图4中可以较明确的看到经CHROMA－SPIN 400柱重力自流法和CHROMA－SPIN 400柱离心法处理过的样品液电泳图在低于500bp范围内仍然有弥散带出现，而胶回收法在500bp以下处几乎没有暗带了，说明胶回收法除去小分子cDNA片段较彻底，而另两种方法虽然使500以下cDNA片段有明显减少，但去除并不彻底。

3.3 综合对比三种方法

结合以上检测结果，从成本、实验用时、去除效果、回收率和一次处理溶液量对3种方法进行综合比较，如表1所示。

表1 三种方法综合比较表

4 结语

从综合对照表和电泳对比图中我们可以看到最新的CHROMA－SPIN 400柱离心法除了操作较简单，实验较快捷之外，在小分子去除效果上与CHROMASPIN 400柱重力自流法相比并没有优势，而且关键的回收率远不及CHROMA－SPIN 400柱重力自流法。而胶回收法实验用时最少，而且小分子片段去除较彻底，只是回收率较低。所以综合来看，当样品量较多时适宜采用胶回收法，不仅小分子片段去除较彻底，成本最低，而且可一次处理大量样品，省时；当样品量较少时，适宜采取CHROMA－SPIN 400柱重力自流法保证回收率，虽然费时一点；反倒是最新的CHROMASPIN 400柱离心法在关键的回收率和小分子去除效果两方面与另两种方法对比，都处于劣势，所以不可取。

笔者分析认为CHROMA－SPIN 400柱离心法与CHROMA－SPIN 400柱重力自流法相比，回收率之所以低很多，是因为离心力使大孔树脂之间聚集太紧密，阻碍了cDNA片段的通过，而重力自流法中的大孔树脂聚集只受重力，不受离心力，所以聚集程度适中，大分子cDNA片段刚好能通过，而小分子cDNA则被大孔树脂吸附。而胶回收法之所以回收率较低，主要是因为有大量核酸样品残留在琼脂糖中，未被选择性溶出，随离心废液一起丢弃了。改变点样量，胶回收中残留洗脱不下来的损失样品量基本不变，所以一次点样越多，损失量不变，回收率就相对提高，可以用这种方法来相对提高胶回收率。另外，最近报道有冻融法、透析袋电洗脱法和低溶点琼脂糖[7]等新的胶回收方法能够显著提高胶回收率，相信这些方法能够弥补胶回收法回收率低这一缺点，而且胶回收法具有要去除的片段大小可以通过肉眼直观，选择切出，选择范围自由的优点。

所以从长远来看，最有潜力成去除全长cDNA溶液中非全长cDNA片段的最佳方法的是胶回收法。

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