杨树基因工程育种研究进展

纪纯阳

(辽宁省杨树研究所，辽宁　盖州　115213)

杨树基因工程育种研究进展

纪纯阳

(辽宁省杨树研究所，辽宁盖州115213)

摘要:该文主要对国内外杨树基因工程育种在抗虫、抗病、抗除草剂、抗旱、抗逆、降低木质素及雄性不育等方面的研究进展进行了综述，详细介绍了各个方面近些年来的研究成果，并对杨树基因工程育种中存在的问题及发展对策进行了讨论。

关键词:杨树;基因工程;育种

杨树不仅是重要的经济树种，在水土保持和维护生态环境方面也发挥重要的作用，我国现已成为世界上杨树人工林面积最大的国家。杨树因速生丰产、实用性强、分布广、无性繁殖能力强、且基因组较小而成为研究林木生理和利用基因工程方法进行遗传改良的理想模式植物。

1986年，Parson等人证实了杨树可以进行遗传转化和外源基因在高等植物细胞中的表现以来，林木基因工程得到了迅速发展，尤其是杨树的基因工程育种进展最为迅速。近年来国内外利用基因工程手段在杨树良种选育研究方面取得了很大进展，尤其在抗虫、抗病、抗除草剂、抗逆等方面。本文详细对国内外杨树基因工程育种研究进展进行了综述，同时对存在的问题及发展对策进行了探讨。

1　杨树基因工程育种研究现状

1.1抗虫基因

抗虫基因主要有2种:一种是苏云金芽孢杆菌

(Bacillus thuringiensis)的δ-内毒素(δ-endotoxin)，简称Bt基因。另一种是蛋白酶抑制因子(Proteinase inhibitor)基因，简称PI基因，其中包括马铃薯蛋白酶抑制因子I(PI-I)、马铃薯蛋白酶抑制因子II(PIII)和豇豆胰蛋白酶抑制因子(CpTI)等，此外还有淀粉酶抑制剂基因和植物外源凝集素基因等。但目前的研究以农杆菌介导法转化Bt基因为主。

1.1.1转Bt基因McCown等用放射性基因枪法将Bt-Cry1Aa基因的融合基因导入银白杨×大齿杨，获得转基因植株Bt-II，对舞毒蛾致死率达24%，天幕毛虫致死率达60%，这是其他转化方法中唯一成功的报道［1］。饶红宇等通过根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导，将苏云金杆菌毒蛋白基因Bt转入杨树NL-80106 (美洲黑杨×小叶杨)，获得了再生植株，PCR分析结果表明，Bt基因已整合到基因组中，部分转基因植株的杀虫实验表明，转基因植株B45和B64对1龄舞毒蛾幼虫有明显抗性，饲喂转基因杨树叶片的幼虫，其死亡率显著

高于饲喂未转基因杨树叶片的幼虫［2］。中国林业科学研究院将苏云金杆菌杀虫蛋白基因Bt导入欧洲黑杨，成功获得了抗叶部害虫的植株。几年后再次用农杆菌对欧美杨叶片和茎段进行转化，共获得225株转化再生植株，以舞毒蛾幼虫进行测定，Bt毒蛋白基因已整合进入抗虫植株的细胞DNA中，并表达出杀虫活性［3］。姜静等将蜘蛛杀虫肽与Bt基因C肽序列的融合基因导入小黑杨中，转基因株系表现出强烈的抗虫效果，能显著抑制舞毒蛾幼虫的生长发育［4］。

高萍等用根癌农杆菌介导法，将Bt毒蛋白基因导入107杨的叶片及茎段外植体，经潮霉素抗性筛选，获得了转基因再生植株。提取转基因植株的总DNA，经PCR扩增，部分植株呈阳性反应，证明目的基因已经整合到杨树基因组中。以转基因杨树叶片饲喂天幕毛虫幼虫的杀虫试验结果表明，转基因杨树表现出一定的杀虫活性［5］。

王连荣等用741杨和转Bt-C ry1Ac基因741杨抗虫株系Pb29互为接穗和砧木进行嫁接。结果表明Bt毒蛋白可以通过嫁接的方式在砧木和接穗间进行运输。用各嫁接处理接穗叶片在室内喂饲杨扇舟蛾幼虫，发现嫁接转基因杨树的非转基因杨可提高对杨扇舟蛾幼虫的致死率，延长发育历期，表现出一定的抗虫性［6］。

1.1.2转蛋白酶抑制因子高等植物的蛋白酶抑制基因是近年来新兴的抗虫基因，在杨树基因转化中已有成功报道。郝贵霞等将广谱抗虫基因豇豆蛋白酶抑制剂(CpTI)基因导入毛白杨(Populus tomentosa Carr.) 1285雌株和毛新杨(P.tomentosa×P.bolleana)×毛白杨回交杂种，PCR鉴定和PCRSouthern检测证实基因已整合进杨树基因组中［7］。Massimo等利用农杆菌介导法将拟南芥半胱氨酸蛋白酶抑制基因Atcys导入白杨(Populus alba L.)中，获得16株转化植株，转化率达到11%。Southern杂交和Northern杂交结果表明，Atcys基因已经整合入白杨的基因组中并正常表达。虫试结果表明，转基因植株能有效地抵抗杨树的叶部害虫［8］。

丁双阳等研究了转CpTI基因杨树对美国白蛾幼虫中肠解毒酶及乙酰胆碱酯酶的影响，结果酯酶、羧酸酯酶的活力受到明显抑制，且随时间的延长，抑制强度增加，饲喂48 h后，酶的活力分别比对照降低76.42%和73.91%;多功能氧化酶在饲喂的前12 h，表现为受到抑制，最大抑制率为35.78%，24 h后酶活力反而高于对照;谷胱甘肽转移酶和乙酰胆碱酯酶活力也受到抑制，两者表现及其相似，在饲喂后4 h抑制作用最强，酶活力分别比对照降低51.40% 和40.57%，但在整个试验过程中，均没有表现出随时间加强的趋势［9］。

1.1.3转复合基因张冰玉等采用农杆菌介导法获得8种银腺杂种杨转双价抗虫基因(Bt-Cry3A和OC-I)植株，其中转基因株系BOGA-39对光肩星天牛幼虫的毒杀和生长抑制作用显著［10］。李明亮等通过农杆菌介导，将人工改造的苏云金杆菌杀虫结晶蛋白基因(Bt)转化杨树，得到杨树再生植株，再将蛋白酶抑制剂基因(PI)导入已含Bt基因的转基因杨树，经PCR检测和Southern杂交分析证明，最终获得既含有Bt基因又含有蛋白酶抑制剂基因的转基因杨树植株。利用这种杨树叶片饲喂舞毒蛾幼虫的杀虫试验结果表明，转基因杨树具有明显的杀虫活性，而且含有Bt基因和蛋白酶抑制剂基因的双基因植株，其抗虫能力明显高于仅含单一Bt基因的植株［11］。饶红宇采用双基因共转法将经改造的Bt-Cry1Aa基因和CpTI基因转入杨树NL280106，获得的转双价基因杨树对1龄舞毒蛾幼虫有明显的杀虫活性［12］。

诸葛强等以南林895杨为转基因受体材料，以嫩芽或腋芽为外植体材料组织培养再生植株，利用农杆菌介导法转化Bt基因和CpTI基因。经培养基培养获得的植株经PCR分析，筛选获得了18株整合有Bt基因和1株整合有CpTI基因的转基因植株。部分转基因植株的初步饲虫实验表明饲喂转基因杨树叶片可明显抑制杨小舟蛾的生长发育［13］。

1.2抗病基因

植物的抗病基因主要有2种:抗病毒基因和抗菌基因。抗病毒基因的研究主要是克隆病毒外壳蛋白基因，通过病毒外壳蛋白基因的导入，并借助交叉保护作用机理，达到降低病毒侵染的目的。抗菌基因主要有几丁质酶基因、抗菌肽基因和防御素基因。1.2.1抗病毒基因Cooper研究人员克隆出杨树花叶病毒的外壳蛋白(PMV-cp)基因，并导入杨树中，可在杨树体内产生cp蛋白，对杨树PMV的侵染起到一种类似于免疫学的交叉保护作用［14］。

1.2.2抗菌基因Harvey研究小组对创伤反应基因在毛果杨×美洲杨无性系中表达进行了研究，发现杨树损伤后产生了3种新的转录子mRNA，其中转录子win6和win8所编码的几丁质酶可以降解侵

染杨树的真菌或细菌的细胞壁，win3转录子所编码的多肽与豆科种子的蛋白酶抑制剂相似具有抑制昆虫的功能。并已将win6基因与GUS报告基因融合，应用于杨树抗病基因的遗传转化，但尚未有成功的报道［15］。Liang等将小麦的草酸盐氧化酶基因(OxO)与CaMV35S启动子连接，转化杂交杨树无性系Populus×euramericana，提高了转化植株的抗病和抗胁迫能力［16］。Mentag等利用农杆菌介导法将编码17个氨基酸的抗菌肽基因D4E1转入杂交杨树(Populus tremula L.×P.alba L.)中，PCR和Northern杂交检测表明，D4E1基因已整合入杂交杨树的核基因组中，转化植株对多种病菌均有明显抗性［17］。

1.3抗除草剂基因

Chupeau等以杂种杨(P.tremula×P.alba)叶片原生质体为受体，采用电击法转化乙酰乳酸合成酶(Als)突变基因，获得了抗磺胺脲类除草剂的工程植株;转化乙酰转移酶(Pat)基因，获得了抗草苷膦类除草剂的工程植株［18］。Gullner等将编码抗除草剂乙酰替绿苯胺(Chloroacetanilide)的谷酰丙氨酶(GST)基因转入杨树杂交种内，转基因植株叶片富含C-GST和谷胱氨酶(GSH)，杨树的除草剂抗性得到提高［19］。Confalonieri等报道获得了高抗草苷膦类除草剂Basta的转基因白杨(P.alba L.)［19］。

1.4抗逆基因

1.4.1抗冻基因利用基因工程培育转基因抗冻杨树的研究尚在探索阶段。Arisi等用拟南芥的Fe-SOD基因转化杨树，发现转基因杨树不仅叶绿体中Fe-SOD活性高于对照5～8倍，而且杨树的抗冻性也明显提高［20］。李春霞从胡萝卜中克隆出抗冻蛋白(AFP)基因并对山杨进行了遗传转化，获得4株卡那霉素抗性苗，经PCR检测分析，其中1株呈阳性，初步表明AFP基因已经整合到山杨基因组中［21］。

1.4.2抗旱基因崔旭东等以欧美杨渤丰1号为试验材料，在对其组织培养再生体系进行优化的基础之上，采用基因枪法对其进行5个抗旱相关基因——转录因子基因JERF36基因、ZxZF基因、AREB基因和功能基因SacB基因、GST基因的共转化，培育出具有强抗旱性的转基因杨树新品种，同时，对外源基因在受体材料基因组上的整合特征进行深入探讨，完善转基因技术的理论基础［22］。

1.4.3耐盐碱基因杨传平等将与甜菜碱合成有关的bet-A基因转入小黑杨中，获得阳性植株，Southern杂交结果表明，bet-A基因已整合进入小黑杨的基因组中，对转化植株进行盐胁迫，测定在不同的处理天数时，非转基因植株与转基因植株之间甜菜碱、脯氨酸、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)的变化［23］。

樊军锋等利用叶盘转化法首次开展了84 K杨双价耐盐基因mtlD/gutD的转化研究，经诱导不定芽及诱导生根阶段卡那霉素连续筛选，获得了16株卡那霉素抗性植株。经PCR检测，有4株呈阳性。耐盐实验表明，3株阳性植株抗NaCl能力，较对照有不同程度提高［24］。

宋建等以盐渍生境下1～2年生107和18-1杨树为材料，对不同树龄和地径的杨树各营养器官中Na+、K+分布变化进行了研究。结果表明，在盐渍生境中种植的含NTHK1的转基因18-1杨树比107杨树更加耐盐，可以更好地抵御盐胁迫，维持离子平衡，NTHK1基因可能是通过增强转基因杨树聚集有害Na+至液泡的能力，以避免细胞质中过高的Na+对细胞造成伤害，从而提高了转基因植株的耐盐性［25］。

孙伟博等将大豆中编码Na+/H+离子逆向转运蛋白的GmNHX1基因构建到植物表达载体pGWB402Ω，通过农杆菌侵染叶盘法转化南林895杨树，PCR检测和Southern杂交结果表明，GmNHX1基因已经整合入南林895杨树基因组。对转GmNHX1基因的南林895杨树耐盐性的生理生化指标进行检测，结果表明GmNHX1基因的表达能够提高转基因杨树的耐盐性［26］。

1.5降低木质素基因

Hu等从白杨中克隆得到4CL基因，通过反义抑制使木质素的含量降低了45%，而纤维素的含量却升高了15%，并能够大大促进白杨的生长［27］。魏建华等将毛白杨(Populus tomentosa Carr.)的CCoAOMT(caffeoyl CoAO-methyltransferase)基因构建了反义表达载体转化杂交杨(P.tremula×P.alba)，发现移栽5～6个月的转基因植株的木质素含量比未转基因对照杨树下降17.9 %［28］。

薛英喜在辅酶A连接酶(4CL)基因杨树和转反义咖啡酰辅酶A3-0-甲基转移酶(CCoAOMT)基因杨树基础上，对反义抑制木质素单体合成酶基因的转基因杨树木材进行了酶解分析，显示5年生杨树，供试转基因杨树的木质素含量均明显低于非转基因对

照;并且即使总木质素含量降低10%，仍未对转基因杨树的生长速度和生物质产量造成明显影响。成熟木材中，抑制CCoAOMT基因表达的转基因杨树植株糖化效率显著提高，而抑制4CL基因表达的转基因杨树植株糖化效率并无显著改变;经烘干、抽提的茎糖化产量与酸溶木质素呈负相关。说明降低酸溶木质素含量可以明显提高生物燃料生产中糖化效率，提高糖化产量［29］。

1.6雄性不育基因

李玲等将TA29-Barnasf基因导入抗虫的转基因欧洲黑杨(P.nigra)基因组中，转TA29-Barnasf基因雄性杨树在田间表现出了高度不育［30］。于来等将不育结构35S-PtAP3-IR-NOS转入到毛白杨中，经检测表明阳性植株中AP3，LFY，PI基因的表达受到明显抑制，对毛白杨花发育将起到一定的抑制作用，本研究为利用转基因手段获得不育材料提供了依据［31］。

1.7其他基因方面

尹吴等以转PEPC基因南林895杨和对照(南林895杨)为材料，分析不同转基因植株的光合生理参数。结果转PEPC基因杨树与C4光合途径相关的酶活性比对照增高，PEPC活性增加较为明显，最高达38.6%。转PEPC基因杨树表现较强的对强光利用能力，其光饱和点比对照提高约10%～20%，饱和点时的光合速率比对照高17.7%～58.1%。转PEPC基因杨树光补偿点低于对照，利用弱光的能力增强; CO2的利用效率较高。此外，转基因杨树羧化效率增高，比对照增加最高达62.3%［32］。

2　杨树基因工程育种存在的问题

转化效率低、实验重复性差是杨树基因工程育种过程中存在的主要问题。由于受气候、环境、人为、实验操作等因素影响，转基因杨树转化效率极低。结合杂交育种的工作经验，每年春季根据杨树花枝的伸展情况，仅能进行1～2批花粉管导入外源DNA基因的杂交育种试验，而且得到的后代仅有几株是含有外源基因。这就要求根据转化植株自身的特点，结合特定的试验转化方法，从实验技术因素到环境因素方面创造有利的转化条件，提高转化效率。

外源基因的插入是随机的，这种偶然性对基因组本身和在DNA/RNA蛋白质及生物性状上的表达都会产生很大的影响。外源基因导入受体内部，只为转基因利用提供了可能性，而受体的表达受到一系列生理生化过程的影响，以复杂的遗传方式表达出来。在实际工作中，通过花粉管导入柳树DNA基因的杂交育种实验中，得到的后代在幼苗期有几株叶形和柳树接近，但随着苗木的生长，慢慢的有的植株有了杨树的叶形，而DNA结构还有待进一步的测定。在早期表达过程中将不能正常表达和表达低的转化植株直接淘汰，增加表达的稳定性。随着科技的发展，能够定点的插入外源基因，保持优良的性状遗传是未来基因工程育种的发展方向。转基因植株性状变异的研究对优良品种的选择具有重大意义。

3　发展对策

目前导入杨树中的抗性基因大多是来源于微生物、植物、控制单一性状的基因。而杨树的一些性状(如抗旱、抗冻等)大都是多基因控制的。结合杨树转抗寒基因的试验，抗寒基因设想从很多抗寒植物中提取，但是只有从山葡萄中提取到了抗寒基因。因此，如何根据林木自身的特点，研究、发掘适合于杨树抗性提高的主基因，将是今后杨树基因工程抗性育种的关键所在。

目前转抗性基因研究多集中在抗虫基因方面，而在抗逆基因、木质素基因及雄性不育基因等方面研究还很少。未来的趋势是增加转基因在其他方面的研究，同时增加双价抗性基因(甚至是多价抗性基因)的研究。育种工作重点转移到其他抗性转基因上，能够选育出更适合的杨树新品种。

转基因杨树被应用于实际种植时要考虑它的生物安全性问题。转基因杨树对人与环境可能产生危害产生新型有害生物、新的过敏原、基因污染等。作者培育出的转基因植株目前处于幼龄期，还未涉及到生物安全性问题。通过新型技术的开发，未来的杨树基因工程育种更能保证转化植株的生物安全性。

基因工程育种将成为未来杨树发展的一个重要趋势。将现代生物技术手段与常规育种方法相结合，不断改良出新品种，是今后发展杨树产业的主要方向。实现转基因杨树的合理化和产业化，必将产生巨大的经济效益、社会效益和生态效益。

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Research advances on genetic engineering breeding of poplar

JI Chun-yang

(Liaoning Provincial Institute of Poplar，Gaizhou 115213)

Abstract:The research progress and achievements made in poplar genetic modification breeding in recent years are summarized in terms of pest resistance，disease resistance，herbicide resistance，drought resistance and another stress resistance，lignin reduction，and male sterility.Some existent problems were discussed and corresponding countermeasures offered.

Key words:Poplar; Gene engineering; Breeding

作者简介:纪纯阳(1982－)，男，辽宁辽阳人，工程师，主要从事杨树生物技术及育种研究工作。E-mail: jichunyang19820125@163.com。

基金项目:辽宁省科学事业公益研究基金项目“杨树转抗寒调控基因育种研究”(2014002016)

收稿日期:2015-02-12;修回日期:2015-03-10

文章编号:1001－7380(2015) 02－0050－05

中图分类号:S792.11; Q943.1

文献标识码:Adoi:10.3969/j.issn.1001－7380.2015.02.012