直肠癌肝转移患者接受西妥昔单抗治疗后出现K-RAS基因突变的检测与治疗探讨

司海燕，王伟兰，戴广海

解放军总医院 肿瘤内二科，北京 100853

西妥昔单抗是以表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)为作用靶点的嵌合性单抗，为目前常用的分子靶向治疗药物。研究表明，K-RAS基因突变可以导致结直肠癌患者对西妥昔单抗原发性耐药[1]，因此《美国国立癌症综合网络(NCCN)结直肠癌临床实践指南》2008版明确指出，所有转移性结直肠癌患者都应检测K-RAS基因状态，并且只有K-RAS野生型患者才建议接受西妥昔单抗治疗。约25%的结直肠癌患者存在K-RAS基因突变，但文献较少对K-RAS野生型晚期大肠癌患者在接受西妥昔单抗治疗期间出现K-RAS基因突变报道。本文报道1例K-RAS野生型直肠癌肝转移患者在接受43个月西妥昔单抗治疗后发生K-RAS突变的病例，并通过相关的文献探讨西妥昔单抗与K-RAS基因发生突变的关系，以了解西妥昔单抗的耐药机制以及后续克服耐药的策略。

资料和方法

1 资料 患者女性，70岁，确诊直肠癌肝转移4年余，直肠切除术后3年8个月，肝局部消融治疗6个月、双肺转移2个月，为行进一步治疗于2015年5月9日入院。

2 方法 针对此例K-RAS野生型直肠癌肝转移患者接受西妥昔单抗治疗后出现K-RAS基因突变的临床资料并文献复习，进行2011年术后标本基因检测及2014年肝转移病灶基因检测，对比检测结果并制订治疗方案，观察及评价治疗效果。结果判读：通过PCR的检测方法，得出肝转移病灶K-RAS基因位点61密码子181C>A Q61K突变的结果。

3 PCR检测 1)DNA提取：取石蜡包埋标本切片，经二甲苯及梯度乙醇脱蜡，加入蛋白酶K消化，按照操作说明书提取DNA，设计引物：第一外显子上游引物5'-ACAGCACTCTGGCTATTT-3'，下游引 物5'-TATCAAAGAATGGTCCTG-3'。2)PCR扩增：PCR反应体系(总体系50 μl)包括10×PCR缓冲液，dNTPs 0.2 mmol/L，Taq DNA聚合酶2 U，基因组DNA 100 ng，MgCI21.5 mmol/L，引物各1 μmol/L，反应条件为94℃变性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸30 s，循环30次，最后72℃延伸5 min。3)电泳鉴定及阳性PCR产物测序：PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳纯化鉴定后，用ABI 3130XL测序仪进行序列分析，测序文件经软件分析后进行结果判读。

结 果

1 病理 2011年5月7日患者术前肠镜活检病理：(直乙交界)中－高分化腺癌。2011年8月30日腹腔镜下行直肠癌切除术。术后病理：浅表溃疡型腺癌，中分化，肿瘤大小1.5 cm×0.5 cm×0.5 cm，肿瘤侵及肌肉层，上、下切缘均未见癌。2014年10月29日肝转移病灶穿刺活检病理：(肝S7段、肝S8段交界近膈病灶)穿刺肝组织内见中分化腺癌浸润，结合病史考虑结肠癌转移可能性大。

2 影像学表现 2011年5月腹部超声示：肝多发低回声结节，转移癌可能性大；乙状结肠管壁增厚，直肠癌可能大。腹部CT：肝内多发转移瘤。结肠气钡双重造影：乙状结肠癌。2015年3月腹部MRI：肝新发转移灶，肺CT：双肺转移。

3 手术 2011年8月30日行腹腔镜下直肠癌切除术。

4 药物治疗 诊断明确后于2011年5 - 7月行5周期西妥昔单抗+奥沙利铂+亚叶酸钙+氟尿嘧啶方案术前转化治疗，治疗后复查肝转移病灶较前明显缩小。于术后9 ~ 12个月行第6 ~ 11周期前述方案化疗(第8周期后因经济因素停用靶向药物)，2012年2月- 2013年4月行第12 ~ 29周期卡培他滨维持治疗。2013年7月- 2014年5月因肝病灶增大更换为FOLFIRI、5-Fu、伊立替康方案＋西妥昔单抗靶向治疗。2014年5 - 12月给予西妥昔单抗维持治疗，后因肝转移灶病理提示K-RAS基因突变停用西妥昔单抗。2014年10月复查肝病灶增大，2014年10月29日行“彩超引导下肝S7、S8段交界近膈病灶穿刺活检手术+肝病灶消融治疗”。2014年11月3日彩超引导下行第2次“肝病灶消融治疗”。2015年3月因肝新发病灶、双肺转移更换为贝伐珠单抗+奥沙利铂方案治疗4周期。

5 基因检测 2011年5月肠镜活检标本基因检测：EGFR、K-RAS未见突变；2014年12月31日术后标本补查K-RAS基因检测未见突变；2014年10月29日肝转移病灶穿刺活检标本基因检测：K-RAS 61密码子181C＞A Q61K基因位点突变，B-RAF、N-RAS未见突变。

6 疗效评价 通过病理科将手术标本与肝转移病灶穿刺标本进行RAS基因检测，得出接受西妥昔单抗治疗后出现K-RAS基因突变及一线治疗无进展生存时间(progression free survival，PFS)43个月，二线治疗PFS 2个月的结果，PFS显著延长，病情得到有效控制。

讨 论

西妥昔单抗是抑制肿瘤细胞EGFR的IgG1单克隆抗体，以比自然配体更高的亲和力与EGFR结合，从而抑制自然配体与EGFR的结合，导致细胞表面受体及受体信号传导下调。K-RAS基因突变是最常见的大肠癌相关基因改变之一。当K-RAS基因呈突变状态时RAS蛋白持续活化，即使阻断上游EGFR也无法调控下游事件的发生，因此肿瘤会持续生长、增殖甚至转移。故一旦K-RAS基因突变，即可导致肿瘤对EGFR单抗耐药[2-3]。因此，K-RAS基因突变型的结直肠癌患者不能从西妥昔单抗治疗中获益，而K-RAS野生型患者可以从西妥昔单抗治疗中获益。本例患者原发灶检测为K-RAS野生型，应用西妥昔单抗治疗3年余，证实该患者确实从西妥昔单抗的治疗中获益。

研究表明，EGFR抑制剂耐药分为原发性耐药和继发性耐药。原发性耐药机制包括细胞内参与EGFR信号转导通路的K-RAS、NRAS、BRAF、PIK3CA、ERBB2、MET基因的突变，PTEN蛋白表达的缺失等[4-6]。继发性耐药机制大概划分为二类：第一类是破坏了西妥昔单抗和EGFR连接的基因突变，如EGFR胞外域S492R的基因突变；第二类是绕过EGFR激活其下游信号途径，如K-RAS或BRAF基因突变，MET或ERBB2的基因扩增等。研究显示，EGFR抑制剂西妥昔单抗治疗转移性结直肠癌(metastaticcolorectalcancer，mCRC)导致了继发性耐药。EGFR胞外域S492R的基因突变在未治疗的CRC患者中没有发现过，只在应用过西妥昔单抗治疗的患者生物样本中发现，也许是西妥昔单抗诱导了耐药[7]。另有报道，西妥昔单抗的使用诱导了K-RAS基因的突变，导致继发性耐药[8-10]。由于肿瘤的异质性，肠癌肝转移患者肿瘤组织中大部分表现为K-RAS野生型细胞，同时有极少量的K-RAS基因突变细胞。西妥昔单抗使K-RAS野生型的细胞被杀死，K-RAS基因突变的细胞不断生长引起继发性耐药。而化疗药物通常不会导致K-RAS基因发生突变。本例患者在西妥昔单抗应用43个月后出现K-RAS基因突变，考虑与西妥昔单抗诱导K-RAS基因发生突变导致继发性耐药有关。

有研究发现，PCR检测接受西妥昔单抗治疗肿瘤患者的外周血循环肿瘤细胞(CTCs)出现K-RAS突变通常较影像学提示肿瘤进展早10个月，因此可考虑作为早期检测西妥昔单抗继发性耐药的重要手段[11]。MEK抑制剂可能逆转K-RAS突变导致的西妥昔单抗继发耐药[12]。K-RAS突变是导致西妥昔单抗原发和继发性耐药的机制之一，随着CTCs这一研究领域的不断发展，检测外周血循环肿瘤细胞可以尽早发现K-RAS基因突变状态，尽早使用MEK抑制剂可能逆转K-RAS突变导致的西妥昔单抗继发耐药。

通过检索2011 - 2015年解放军总医院肿瘤内二科日间病房4年100余例晚期结直肠癌患者病例，其中10例由病理科进行原发灶及转移病灶RAS基因检测，目前仅此1例经治疗后出现K-RAS基因突变，提示增加送检率及再次穿刺转移病灶进行基因检测的必要性。

1 施敏，张俊，朱正纲．EGFR单抗治疗晚期结直肠癌的疗效预测标志物的研究进展［J］.世界华人消化杂志，2010，18（36）：3831-3837．

2 Soulières D， Greer W， Magliocco AM， et al. KRAS mutation testing in the treatment of metastatic colorectal cancer with anti-EGFR therapies［J］. Curr Oncol， 2010， 17（S1）：S31-S40.

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7 Esposito C， Rachiglio AM， La Porta ML， et al. The S492R EGFR ectodomain mutation is never detected in KRAS wild-type colorectal carcinoma before exposure to EGFR monoclonal antibodies［J］.Cancer Biol Ther， 2013， 14（12）： 1143-1146.

8 Misale S， Yaeger R， Hobor S， et al. Emergence of KRAS mutations and acquired resistance to anti-EGFR therapy in colorectal cancer［J］.Nature， 2012， 486（744）： 532-536.

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10 Molinari F， Martin V， Saletti P， et al. Differing deregulation of EGFR and downstream proteins in primary colorectal cancer and related metastatic sites May be clinically relevant［J］. Br J Cancer， 2009，100（7）： 1087-1094.

11 Bouchahda M， Karaboué A， Saffroy R， et al. Acquired KRAS mutations during progression of colorectal cancer metastases：possible implications for therapy and prognosis［J］. Cancer Chemother Pharmacol， 2010， 66（3）： 605-609.

12 Troiani T， Napolitano S， Vitagliano D， et al. Primary and acquired resistance of colorectal cancer cells to anti-EGFR antibodies converge on MEK/ERK pathway activation and can be overcome by combined MEK/EGFR inhibition［J］. Clin Cancer Res， 2014， 20（14）：3775-3786.