脂肪酸代谢预处理及其检测方法的研究进展

李美艳，赵庆豪，刘丽清 综述，王爱武△ 审校

(1.山东大学附属省立医院，济南 250021;2.山东中医药大学，济南 250355；3.山东大学医学院，济南 250021)



·综 述·

脂肪酸代谢预处理及其检测方法的研究进展

李美艳1,2，赵庆豪3，刘丽清1综述，王爱武1,2△审校

(1.山东大学附属省立医院，济南 250021;2.山东中医药大学，济南 250355；3.山东大学医学院，济南 250021)

脂肪酸代谢； 前处理方法； 甲酯化方法； 色谱分析

脂肪酸是指一端含有一个羧基的长的脂肪族碳氢链，是机体主要能量来源之一。脂肪酸根据碳链的长短可分为短链、中链、长链脂肪酸；根据饱和度的不同可分为饱和、单不饱和、多不饱和脂肪酸。人和动物体内脂肪酸主要是长链脂肪酸，其来源一是机体自身合成，二是食物供给。脂肪酸在生命过程中具有非常重要的作用。研究表明，诸如高血压、血脂紊乱、肥胖、胰岛素抵抗、心脑血管疾病及肿瘤等多种疾病都与脂肪酸代谢异常有关[1-4]，因而脂肪酸代谢的研究越来越受到重视。本文对脂肪酸代谢检测常用的前处理方法、甲酯化方法及色谱分析条件等综述如下。

1 脂肪酸代谢检测的前处理方法

1.1 动物组织脂肪酸检测的前处理 组织脂质的提取方法多采用经典的Folch法,具体方法是首先称取一定量的组织，加入一定的氯仿/甲醇混合溶媒进行匀浆，再加入蒸馏水离心处理[5]。也有研究者先用生理盐水进行匀浆，再用氯仿/甲醇进行脂质提取。禹晓等[6]研究α-亚麻酸对高脂模型大鼠组织脂肪酸代谢的影响。称取0.10 g组织(肝脏、脑、肾及心)，放入玻璃手动均质器中，加入5 mL氯仿/甲醇(2∶1)，缓慢均质1 min，过滤定容至5 mL。再加1 mL蒸馏水混匀，3 000 r/min离心15 min，除去溶剂上相，再用氯仿/甲醇/水(3∶48∶47)冲洗溶剂界面3次，下相及部分冲洗液加入甲醇后融为一相，氮气(N2)吹干，-20 ℃保存至分析。 张侃等[7]对大鼠脑组织中必需脂肪酸进行研究。称取脑组织5 g，加入3 mL氯仿/甲醇(1∶2)，搅拌2 min，加氯仿5 mL搅拌30 s。再加蒸馏水5 mL搅拌30 s，抽滤，用少量氯仿洗涤残渣。所得滤液静止分层，分离，得油层待酯化分析用。李霖[8]选用-80 ℃保存下的80～120 mg大鼠肝脏组织放入匀浆器中，加1 mL生理盐水研磨成匀浆，分两次加氯仿2 mL，甲醇1 mL，合并2次提取液，下相用N2吹干后置-40 ℃冰箱中保存备用。

1.2 血清脂肪酸检测的前处理 血清中的游离脂肪酸能初步反映机体代谢是否紊乱，且由于血清标本制作过程简单，关于血清脂肪酸的研究也较多。崔瑞芳[9]将收集到的-80 ℃保存的血液标本于室温下静置1 h凝固后，在4 ℃下3 500 r/min离心15 min，分离血清，每份标本200 μL，分装后冻存于-80 ℃备用。宋虎等[10]将血清标本100 μL加入300 μL氯仿/甲醇(1∶3)，涡旋振荡30 s，混合液于-20 ℃沉淀10 min，4 ℃ 16 000 r/min离心10 min后，取上清液200 μL待衍生化用。

1.3 血浆脂肪酸检测的前处理 血浆中游离脂肪酸的种类和浓度可以反映某些疾病与脂肪酸的关系，为进一步研究脂肪酸代谢做好基础。谭斌斌[11]提取人体血浆中脂肪酸时，将收集到的血液标本立即以3 000 r/min离心10 min，分离所得血浆置-80 ℃保存待衍生化用。

1.4 红细胞膜脂肪酸检测的前处理 红细胞膜是包裹在红细胞外，具有磷脂双分子层结构的天然生物膜，虽然其本身并不具有脂质合成的能力，但其脂质代谢受红细胞生理状态的影响。杨芳等[12]吸取血液500 μL，按1∶30比例加入10 mmol/L pH=7.4的低渗三(羟甲基)氨基甲烷缓冲液于15 mL试管中，轻摇混匀后放置4 ℃冰箱中溶血后，于4 ℃，9 000 r/min离心30 min，弃上层血清，再重复洗涤离心3次，得乳白色红细胞膜。取100 μL 乳白色红细胞膜于1 mL磷酸盐缓冲液中，加入内标十九碳烷酸500 μL( 0.1 mg/mL，再加入2 mL氯仿/甲醇混合液(2∶1)，剧烈震荡1 min，3 000 r/min离心5 min，吸取全部氯仿层，移至玻璃试管，N2吹干备用。

1.5 尿液脂肪酸检测的前处理 检测尿液中脂肪酸组成具有无创伤性、方便等优点，尿液常常用于体内脂肪酸的检测。元冬娟等[13]取15 mL健康人晨尿于3 000 r/min离心10 min后取上清液5 mL，加15 mL氯仿/甲醇(2∶1)溶液，涡旋2 min，在室温静置60 min后取下层至密闭管，N2吹干备用。

2 甲酯化方法

脂肪酸的甲酯化方法主要包括酸处理法、碱处理法、三氟化硼方法等。不同的甲酯化方法适用对象有所不同，所用试剂的浓度、甲酯化温度和时间等条件都会影响到脂肪酸的检测。

2.1 酸处理法 酸催化法一般采用硫酸-甲醇(H2SO4/MeOH)溶液进行甲酯化。李海静等[14]取正常人血清200 μL，加入2.5% H2SO4/MeOH溶液1 mL，在60 ℃条件下水浴90 min，加1.5 mL生理盐水溶液和1 mL正己烷，振荡混匀，3 000 r/min离心5 min，取上层正己烷层N2吹干，正己烷复溶进样。韩莉妲[15]将分别含有酯化脂肪酸和非酯化脂肪酸的提取液吹干后，立即加入衍生化试剂5%H2SO4/MeOH溶液500 μL，密封反应体系中加热至70 ℃，反应30 min。待反应完毕后，放冷至室温，加入200 μL的水。以正己烷500 μL萃取衍生化产物脂肪酸甲酯，上清液移至进样瓶中，定容为500 μL，待进样分析用。徐小作等[16]取血清0.5 mL，加入10% H2SO4/MeOH 1 mL，涡旋振荡混匀，置60 ℃水浴1 h，取出冷至室温，加入正己烷和饱和氯化钠溶液各2 mL，涡旋混匀3 min，静止30 min，3 000 r/ min离心10 min，取上层正己烷1.0 mL，N2吹干，待进样分析用。

2.2 碱处理法 碱衍生方法一般常用的为氢氧化钾-甲醇(KOH-MeOH)衍生法。孙莲等[17]将芜菁子油32 mg置于10 mL量瓶中，加丙酮定容，精密吸取100 μL至刻度试管，N2吹干。加0.4 mL，0.5 mol/L氢氧化钾-甲醇(KOH-CH3OH)溶液，60 ℃恒温水浴皂化30 min，待油珠完全溶解，N2吹干备用。暴雪等[18]将文冠果种仁油约80 mg置25 mL量瓶中用丙酮溶解并稀释至刻度。精密量取50 μL，加0.4 mL，0.5 mol/L KOH-CH3OH，振摇1 min，60 ℃水浴30 min。冷却后，加异丙醇/正庚烷/冰醋酸(40∶10∶1)溶液2.5 mL，涡旋1 min，间断超声2 min，室温下放置10 min，再精密加正庚烷1 mL，水1.5 mL，涡旋1 min，间断超声2 min，离心10 min后精密吸取上清液0.5 mL，N2吹干备用。

2.3 三氟化硼方法 三氟化硼方法进行甲酯化时，一般选用三氟化硼-甲醇(BF3/MeOH)溶液。伍金华等[19]优选脂肪酸甲酯化方法，在甲酯化试管中依次加入1 mL 正己烷，80 μL含十七烷酸甲酯内标物的无水甲醇溶液以及干燥后的细胞膜沉淀物，混匀后加入14%的BF3/MeOH 2 mL ，立刻充氮气密封。在100 ℃条件下水浴60 min，冷却后加入0.5 mL 的三蒸水，2 000 r/min离心5 min。取上清液，N2流吹下浓缩至20 μL，-20 ℃保存备用。Abu等[20]在测量二十碳五烯酸/二十二碳六烯酸指数时，将血液处理得到的脂肪酸提取液中加入25%的BF3/MeOH溶液1 mL，在80 ℃水浴条件下加热60 min，冷却至室温后，将脂肪酸甲酯萃取到己烷保存备用。

3 脂肪酸检测的分析方法

3.1 气相色谱-质谱联用(GC-MS)方法 对于大多数的脂肪和脂肪酸而言， GC-MS方法是其最佳的分析方法，也是比较常用的。不同的研究者采用的色谱柱不太相同，其程序升温等分析条件及检测到的脂肪酸也不同。吴毅等[21]采用 Inowax(0.32 mm×30 m，0.25 μm)弹性石英毛细管色谱柱，程序升温，初温110 ℃保持3 min，以2 ℃/min升温至164 ℃，保持10 min，再以8 ℃/min升温至210 ℃，保持10 min。检测到月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、棕榈油酸、硬脂酸、油酸、α-亚麻酸、亚油酸、γ-亚油酸等9种脂肪酸。芮雯等[22]以GC-MS方法，采用DB-5色谱柱(30 m×50 μm×0.25 μm)色谱柱，程序升温为60 ℃，初温保留2 min，、以30 ℃/min升至120 ℃，再以3 ℃/min升温至250 ℃，保持20 min。检测到14种脂肪酸成分，其中蜈蚣藻以棕榈酸为主，带形蜈蚣藻以二十碳二烯酸为主。王秀琴等[23]用采用DB-5(60 m×0.25mm，0.25μm)毛细管色谱柱，程序升温：柱起始温度50 ℃，以3 ℃/min升到230 ℃保持20 min检测到亚油酸、油酸、肉豆蔻酸、棕桐酸、硬脂酸、α-亚麻酸、山嵛酸、亚油酸、花生酸、二十碳烯、焦油酸等11种脂肪酸成分。

3.2 高效液相色谱与质谱联用(HPLC-MS)方法 近年来一些研究者也尝试用HPLC-MS方法对某些脂肪酸进行分析。采用柱前衍生-高效液相色谱法检测脂肪酸水平，可以避免气相色谱法较高柱温引起的成分不稳定。 常用的衍生化试剂有二溴苯乙酮、2-硝基苯肼盐酸盐等。王晓丽等[24]以HPLC-MS方法，采用Kromasil C8反相色谱柱(250 mm×416 mm，5 μm)，检测波长254 nm，以甲醇/乙腈/水(60∶30∶10 )为流动相等度洗脱，柱温为室温，流速为110 mL/min。一次基线分离得到α-亚麻酸、亚油酸、棕榈酸、硬脂酸4种脂肪酸，建立注射用沙棘籽油的脂肪酸水平检测的方法。杨必成等[25]采用YMCJ，sphere ODS-H80(250 mm×4.6 mm，4 μm)色谱柱，乙腈-水梯度洗脱，体积流量为1.00 mL/min，ELSD漂移管温度85 ℃，气体为空气，气体体积流量为3.0 L/min，柱温为35 ℃。检测到亚麻酸酰胺、亚麻酸甘油酯、亚麻酸、棕榈酸4种脂肪酸化合物。

4 小结与展望

本文系统总结了常用的脂肪酸检测的前处理方法、甲酯化方法、定量分析方法。脂肪酸代谢检测的标本包括动物组织、血清、血浆、血红细胞、尿液等标本；不同的标本前处理方法有所不同，即使同一标本采用不同的甲酯化方法及分析方法所得的脂肪酸种类和水平也会有所不同。因此，研究中必须针对不同的实验对象和实验目的进行方法优选。

常用的前处理方法称取一定的组织，经Folch试剂(氯仿/甲醇=2/1)进行匀浆提取脂质。由于用氯仿易挥发，有研究者先用生理盐水进行匀浆，再用氯仿/甲醇进行脂质提取。

甲酯化方法有酸处理法、碱处理法和三氟化硼法等，其中酸处理法既适于游离脂肪酸，又适合于结合态脂肪酸(脂肪)；碱法甲酯化只适合于脂肪；由于三氟化硼法很难将脂类完全提取，不太常用。以硫酸/甲醇溶液进行甲酯化方法最为常用，以80 ℃反应60 min为最佳反应条件。

脂肪酸分析方法以GC-MS、HPLC-MS最为常用。GC-MS法一般需要先将脂肪酸采用酸催化法与碱催化法制备脂肪酸甲酯化产物，具有谱库大，速度快，节省流动相，普通实验室即可实现，成本低等优点，因此最为常用，但此方法具有定量不够准确，灵敏度欠佳，稳定性差等缺点；HPLC-MS法具有较高的灵敏度，节省了甲酯化处理过程，近年来比较常用，但需要采用柱前衍生处理，衍生过程需在氢氧化钾、冠醚及相转移催化剂的存在下于苯或甲苯中完成，进样前需进行繁琐的预处理，费时、费力。

综合文献分析，临床医学上很多疾病和脂肪酸的变化有密切关系，机体器官生理和病理变化往往会引起体内脂肪酸成分的改变，检测机体中脂肪酸的水平，对研究不同条件下血脂代谢情况，诊断某种脂肪酸水平异常引起的疾病以及调整补充机体所需、改善营养疗效等方面具有重要意义。因此对脂肪酸代谢的检测对及时了解脂肪酸代谢疾病非常重要，更方便、快捷、准确的脂肪酸检测方法还有待研究者的进一步探讨。

[1]Suburu J，Gu Z，Chen H.Fatty acid metabolism:Implications for diet，genetic variation，and disease[J].Food Bioscience，2013，12(4):1-12.

[2]Murphy RA，Mourtzakis M，Mazurak VC.N-3 polyunsaturated fatty acids:The potential role for supplementation in cancer[J].Curr Opin Clin Nutr，2012，3(15):246-251.

[3]马晓丽，田兰，李琳琳，等.基于气相色谱的血清中游离脂肪酸代谢轮廓分析区分糖尿病与正常人[J].分析科学学报，2013，5(29):615-620.

[4]Hellemons ME，Kerschbaum J，Bakker SJ，et al.Validity of biomarkers predicting onset or progression of nephropathy in patients with Type 2 diabetes:a systematic review[J].Diabet Med，2012，29(5):567-577.

[5] Sin HG,Jens R,Francisco J，et al.Accumulation of retinol in the liver after prolonged hyporetinolemia in the vitamin A-sufficient rat [J].J Lipid Res,2005,46(4):641-649.

[6]禹晓，邓乾春，黄凤洪，等.α-亚麻酸对高脂模型大鼠组织脂肪酸代谢的影响[J].天然产物研究与开发，2012，24:25-34.

[7]张侃，曾琳，龙在云，等.必需脂肪酸对大鼠脑组织中EPA_DHA水平的影响及意义[J].第三军医大学学报，2005，12(27):1213-1215.

[8]李霖.大鼠非酒精性脂肪性肝病肝脏脂肪酸谱的研究[D].杭州:浙江大学医学院，2007:27-29.

[9]崔瑞芳.高效液相色谱检测血清胆固醇酯n-3脂肪酸指数[D].北京:北京协和医学院，2010:15-16.

[10]宋虎，彭俊生，杜艳平，等.胃癌血清脂肪酸和脂肪酸酰胺水平的变化及其意义[J].实用医学杂志，2011，16(27):2947-2950.

[11]谭斌斌.2型糖尿病患者血浆中脂肪酸代谢谱的研究[D].长沙:中南大学，2010:18-20.

[12]杨芳，李忠霞，郑琳，等.气相色谱法检测人红细胞膜反式脂肪酸水平[J].华南预防医学，2012，6(38):64-66.

[13]元冬娟，康景轩，周克元，等.尿液中脂类的萃取及健康人脂肪酸成分的分析[J].第四军医大学学报，2009，30(19):2021-2024.

[14]李海静，吴胜明，李显，等.人血清中脂肪酸的GC-MS分析[J].分析测试学报，2008，11(27):37-38.

[15]韩莉妲.基于GC/MS技术的脂肪酸代谢轮廓谱方法和应用研究[D].上海:华东理工大学，2009:23-24.

[16] 徐小作，李行方，钟伟燕，等.人血清中7种多不饱和脂肪酸检测方法研究[J].黑龙江医学，2010，34(1):30-32.

[17]孙莲，孟磊，马合木提，等.GC -MS法及柱前衍生HPLC法检测芜菁子中油脂的组成和水平[J].华西药学杂志，2011，1(26):62-64.

[18]暴雪，高英，玉荣，等.柱前衍生化-HPLC法检测文冠果种仁油中脂肪酸水平[J].北方药学杂志，2012，9(1):3-4.

[19]伍金华，温鹏强，蔡春，等.一种红细胞膜脂肪酸甲酯化的改良方法[J].现代预防医学，2008，22(35):4461-4463.

[20]Abu EO，Oluwatowoju I.Omega-3 index determined by gas chromatography with electron impact mass spectrometry[J].Prostaglandins Leukot Essent Fatty Acids，2009，80(4):189-194.

[21]吴毅，李晓东，罗晓清，等.衍生化GC-MS同时检测鱼腥草药材中9种脂肪酸的水平[J].中国药学杂志，2009，44(7):545-547.

[22]芮雯，岑颖洲，伍秋明.蜈蚣藻和带形蜈蚣藻脂肪酸成分和无机元素含量分析[J].广东药学院学报，2010，26(1):48-50.

[23]王秀琴，李军，李岚，等.GC-M S分析不同产地天仙子及其炮制品中的脂肪酸成分[J].中华中医药学刊，2013，1(31):166-168.

[24]王晓丽，杨明明，迟娜，等.柱前衍生化-HPLC法同时检测注射用沙棘籽油中脂肪酸的水平[J].沈阳药科大学学报，2010，27(10):808-812.

[25]杨必成，刘海，杨义芳，等.HPLC-ELSD 检测油菜花粉抗前列腺增生活性部位中4种脂肪酸类化合物[J].中草药，2012，10(43):1967-1970.

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.06.055

A

1672-9455(2015)06-0848-02

2013-08-22

2013-10-22)

△通讯作者，E-mail:wangaw66@163.com。